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目的:血管内皮细胞损伤与高血压病的发生、发展关系密切。采用益肾法治疗高血压病可取得较好的临床疗效,并且益肾法对血管内皮细胞可发挥一定的保护作用,但目前益肾法保护血管内皮细胞的机制尚不十分明确。本研究探讨益肾法对血管内皮细胞损伤的干预机制,可为中医临床从益肾入手来防治高血压病血管内皮细胞损伤提供理论依据。
方法:培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并进行鉴定。采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导HUVEC损伤为实验模型。分别给大鼠灌服杞菊地黄丸(大剂量3g/d·kg,小剂量0.75g/d·kg)、右归丸(大剂量9g/d·kg,小剂量2.25g/d·kg)、杞菊地黄丸与右归丸的合方(简称“合方”,大剂量12g/d·kg,小剂量3g/d·kg),制备各中药含药血清。实验分为正常对照组,AngⅡ损伤组,空白血清组,杞菊血清大、小剂量组,右归血清大、小剂量组,合方血清大、小剂量组,阿托伐他汀大、小剂量组。倒置显微镜下观察活细胞状态下细胞的形态；制备细胞爬片(HE染色),光镜下观察细胞的形态；制备细胞超薄切片,透射电镜下观察细胞超微结构；测定细胞的生长曲线；用激光共聚焦显微镜检测细胞内线粒体膜电位水平和细胞内钙离子浓度；Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖活力；分别收集各组细胞培养液上清,采用硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)的活力,采用酶免法检测内皮型一氧化氮合酶3(eNOS-3)的含量。
结果:
1.HUVEC的培养与鉴定培养的HUVEC在倒置镜下呈椭圆形或铺路石样镶嵌排列,细胞为扁平多角形,边界清楚,胞浆丰富,胞核清晰可见；在电子显微镜下可见胞浆内的内质网、线粒体、胞核以及核仁等结构,内质网呈扁平囊状、线粒体呈棒状,胞核以及核仁明显；经HE染色后,光镜下可见细胞呈圆形、梭形或多边形,胞浆内棕色颗粒,核周密集,说明是内皮细胞。
2.细胞生长曲线的测定培养的HUVEC的生长曲线基本呈“S”型,在第0-2天生长缓慢,第2—5天进入对数生长期,第5—6天生长缓慢,进入平台期。取对数生长期的细胞进行实验。
3.透射电镜观察细胞的超微结构电子显微镜检测显示,AngⅡ损伤组细胞出现内质网扩张,线粒体肿胀呈圆形或椭圆形等细胞明显受损的特征,而杞菊血清大剂量组与合方血清大剂量组内皮细胞内质网呈扁平囊状,线粒体呈棒状,结构基本正常,损伤程度低于AngⅡ损伤组以及空白血清组。
4.激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位细胞线粒体膜电位水平的比较,与空白血清组相比,杞菊血清大剂量组以及合方血清大、小剂量组细胞线粒体膜电位水平升高,差异有统计学意义。与 AngⅡ损伤组相比,阿托伐他汀大、小剂量组细胞线粒体膜电位水平升高,差异有统计学意义。且各药物组之间均无差异。
5.激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度细胞内钙离子浓度的比较,与空白血清组相比,杞菊血清小剂量组细胞内钙离子水平降低,差异有统计学意义。
6.CCK-8法检测细胞增殖活力细胞增殖活力的比较,与空白血清组相比,右归血清大、小剂量组和合方血清大、小剂量组细胞增殖活力增高,且四者之间无差异。
7.硝酸还原酶法检测NO浓度、NOS活性及酶免法检测eNOS-3含量细胞的NO浓度比较,与正常对照组相比,AngⅡ损伤组无统计学意义；但是,与空白血清组相比,杞菊血清大剂量组NO浓度有增高的趋势；与AngⅡ损伤组相比,阿托伐他汀大、小剂量组NO浓度也有增高的趋势。
细胞的NOS活性比较,与正常对照组相比,AngⅡ损伤组无统计学意义；但是,与空白血清组相比,杞菊血清小剂量组、右归血清大、小剂量组以及合方血清大剂量组NOS浓度有增高的趋势。
细胞的eNOS-3含量比较,与正常对照组相比,AngⅡ损伤组无统计学意义；但是,与空白血清组相比,杞菊血清大剂量组、合方血清大剂量组eNOS-3含量有增高的趋势；与 AngⅡ损伤组相比,阿托伐他汀大剂量组eNOS-3含量也有增高的趋势。
结论:
1.实验中用AngⅡ作用于HUVEC后,观察到细胞的超微结构出现明显受损特征,检测到细胞的线粒体膜电位水平降低、细胞内钙离子浓度升高、细胞的增殖活力降低,说明细胞损伤模型成立。
2.杞菊地黄丸大剂量和合方大剂量对受损细胞的内质网和线粒体等超微结构有保护作用。
3.杞菊地黄丸大剂量、合方以及阿托伐他汀均对细胞线粒体膜电位水平有升高作用。
4.杞菊地黄丸小剂量能降低细胞内钙离子浓度。
5.右归丸和合方能增强细胞的增殖活力。
6.杞菊地黄丸、右归丸、合方及阿托伐他汀均有升高NO系统指标的趋势。
总之,益肾中药(滋补肾阴药、温补肾阳药以及阴阳双补药)可通过改善细胞的超微结构、升高细胞的线粒体膜电位、降低细胞内钙离子浓度、促进细胞增殖、升高NO和eNOS-3含量、增强NOS活性而发挥对内皮细胞的保护作用。提示益肾法(滋补肾阴法、温补肾阳法以及阴阳双补法)可通过改善内皮细胞的超微结构,调节细胞的线粒体膜电位、钙离子浓度,影响内皮细胞增殖,调节NO系统而发挥对高血压内皮细胞的保护作用。益肾中药对内皮细胞的保护作用为说明益肾法能发挥对内皮细胞的保护作用提供了实验依据。