骨移植是修复骨缺损的方法之一,目前常用的修复材料有自体骨、异体骨及人工合成材料,这些材料均在不同程度上存在缺陷,无法满足临床需要。如自体骨移植虽无免疫排斥反应,修复效果良好,但取材十分有限,且造成供区的骨缺损;同种异体骨移植容易引起免疫排斥反应,修复效果差,并有传染病毒性疾病的危险,而且取样、处理、存储的成本高,其应用受到很大限制;人工合成材料如聚甲丙烯酸甲酯、硫化硅橡胶等都是非降解材料,因此修复缺损区后还存在二次手术的问题。所以目前医学和生物材料科学领域中的一个研究热点是研制理想的生物人工材料代替现在所使用的骨移植材料,组织工程骨应运而生。组织工程骨是利用生物组织工程技术将种子细胞与支架材料复合,形成具有与自体骨结构功能相似的骨组织,迄今已经取得了很大的进步,但是也存在一些问题,如组织工程骨缺乏营养供给。组织工程骨在体外培养时通过更换培养液供给营养、维持代谢;当细胞支架复合物植入体内,即由血液-细胞间液完成细胞的营养供应。充分的血液供应是保证其体内存活的决定性因素。但是,复合物植入后与周围组织建立血液循环需时较长,导致内部细胞缺乏足够的营养和代谢,其增殖、分化、分泌功能必将受到影响,甚至死亡。因此尽早建立血运,为后期骨形成所需的大量血供提供保障,才能保留复合物的成骨优势。目前实现组织工程骨血管化有多种方法,其中之一是成骨细胞+血管内皮细胞(endothelial cell, EC)+生物材料,成骨细胞和EC获取不易,过程繁琐;而骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)提取简单、具有多向分化潜能,可以定向诱导为成骨细胞、软骨细胞等多种细胞,是骨组织工程乃至组织工程种子细胞的热门选择。是否可以在一个微环境中使BMSCs同时向成骨细胞和EC分化,从而简化血管化组织工程骨构建过程中的种子细胞的获取过程,进而简化血管化组织工程骨构建过程?如果该假设成立,那么会为具有复杂组织的大器官的构建提供一定的理论和实验依据。海藻酸钠无毒,生物相容性良好,并且在与二价离子偶联后可以形成海藻酸钠凝胶,具有一定的可塑性,目前被广泛用于组织工程领域。因此,作者选择BMSCs作为种子细胞,采用海藻酸钠作为种子细胞的支架材料,从骨诱导性、细胞界面、三维立体多孔结构的孔隙率、孔径大小等方面对海藻酸钠作为一种适宜骨组织工程的支架材料作出评价,并初步探讨BMSCs/海藻酸钠凝胶复合物构建血管化组织工程骨的可行性。目的1检测2D海藻酸钠凝胶对BMSCs的生物学效应(生物相容性、骨诱导性),初步探讨海藻酸钠凝胶作为较合适的骨组织工程的支架材料的可行性。2检测2D海藻酸钠凝胶和成骨诱导剂联合应用促进BMSCs向成骨细胞分化的作用。3探讨使用EC诱导剂诱导BMSCs在2D海藻酸钠凝胶上向EC分化的可行性。4在将BMSCs分别诱导成功以后,在2D海藻酸钠凝胶上将两种诱导培养液以1:1的比例混合培养BMSCs,初步观察BMSCs的分化情况。探索BMSCs向不同组织细胞同时分化的可能性。5海藻酸钠凝胶要作为合格的支架需要具有立体三维结构,摸索构建3D海藻酸钠凝胶的方法,构建符合骨组织工程需要的三维支架。6构建BMSCs/ 3D海藻酸钠凝胶的细胞支架复合物,初步探讨生成血管化的组织工程骨的可行性。方法1制备2D海藻酸钠凝胶,用扫描电镜观察2D海藻酸钠凝胶的表面以观察凝胶的细胞界面;在0、3、6、9、12d称量海藻酸钠凝胶脱水后的重量以观察培养过程中海藻酸钠凝胶随着时间增加的降解情况;提取大鼠原代BMSCs种植到凝胶上,分为凝胶组(实验组)和培养板组(对照组),用MTT检测BMSCs在两组的增殖;RT-PCR检测BMSCs成骨基因的表达以观察海藻酸钠凝胶对BMSCs的生物相容性以及骨诱导性。2使用成骨诱导剂,实验分为3组:12孔板加成骨诱导剂培养组(A组);在2D海藻酸钠凝胶上用完全培养液培养组(B组)和在海藻酸钠凝胶上用成骨诱导剂培养组(C组)。称量B组和C组海藻酸钠凝胶脱水后的重量,以观察海藻酸钠凝胶在两种培养液中降解情况;MTT检测BMSCs在三个组的增殖情况以观察使用成骨诱导剂后对细胞增殖的影响;甲苯胺蓝染色观察BMSCs在B组和C组的形态变化;A组用von Kossa染色,A、B和C三组均用骨钙素免疫细胞化学染色和RT-PCR检测成骨情况。3采用免疫组织化学、免疫荧光化学检测EC特异性表达的vWF的存在,Wistar大鼠舌组织血管作为阳性对照;RT-PCR检测内皮素-1的基因表达,以检测BMSCs在EC诱导剂的作用下向EC的分化情况。4将BMSCs采用成骨诱导剂和EC诱导剂混合培养,分为爬片组和凝胶组,以及在凝胶上单独使用成骨诱导剂和EC诱导剂作为对照组。倒置显微镜和HE染色观察细胞总体的形态变化,爬片组的细胞分别进行骨钙素和vWF免疫细胞化学染色,以探讨BMSCs向成骨细胞和EC的分化情况,用图像分析系统测定BMSCs向EC的分化率。透射电镜检测细胞超微结构的改变;凝胶组细胞消化爬片后进行荧光双标(红色:EC的标志物vWF呈阳性;绿色;成骨细胞的标志物骨钙素为阳性)并在激光共聚焦显微镜下进一步观察细胞向两个方向分化的情况。5采用冰冻法制备3D海藻酸钠凝胶,采用液体替代法测定孔隙率,扫描电镜和石蜡切片HE染色观察孔隙形成情况,图像分析系统检测孔径大小。6构建BMSCs/ 3D海藻酸钠凝胶的细胞支架复合物,分为使用成骨诱导剂和EC诱导剂混合培养的细胞支架复合物组(A组)、使用成骨诱导剂培养的细胞支架复合物(B组)、移植时只加入3D海藻酸钠凝胶组(C组)和未进行移植复合物的组(D组),移植到Wistar大鼠背部的皮下组织。X-ray在0、4和6w观察钙化情况;组织块用石蜡包埋切片后进行von Kossa染色观察钙盐沉积情况,HE染色观察组织块的钙化、细胞形态的改变等,分析其向成骨方向和血管方向分化的情况。用图像分析系统分析血管的面密度以比较各组血管的增生情况。结果1、扫描电镜下,2D海藻酸钠凝胶的表面粗糙,呈颗粒状,相互粘连,高低起伏;在完全培养液里海藻酸钠凝胶随着时间的延长而逐渐降解;BMSCs在凝胶上生长良好,增殖能力未受影响;凝胶上和培养板上的BMSCs都有成骨相关基因(碱性磷酸酶和I型胶原)的表达,以凝胶组为高,骨连接蛋白则只在凝胶组有表达。提示BMSCs具有自发向成骨细胞分化的潜能;海藻酸钠凝胶是一种较适宜的骨组织工程支架材料。2在成骨诱导剂和完全培养液中2D海藻酸钠凝胶都随着时间延长而降解,组间无差异;BMSCs在三个组生长情况良好,组间无差异;甲苯胺蓝染色可见凝胶上细胞的集落样生长、von Kossa染色可见黑色钙化斑、骨钙素免疫细胞化学染色可见胞浆为棕黄色,结果提示各组的BMSCs向成骨细胞分化;RT-PCR的结果则表明培养12d时,三个组的碱性磷酸酶和I型胶原和骨连接蛋白均有阳性表达,但A组和C组的表达量明显高于B组,C组的表达量最高(图2-6),提示海藻酸钠凝胶和成骨诱导剂同时应用将能更好地诱导BMSCs,使其更快进入分化阶段。3 EC标志物vWF的免疫细胞化学染色和荧光免疫细胞化学均为阳性:免疫细胞化学染色可见胞浆染为棕黄色;荧光免疫细胞化学可见红色荧光。RT-PCR显示由EC分泌的内皮素-1的基因有表达。提示BMSCs向EC分化成功。4爬片组(采用成骨诱导剂和EC诱导剂)的细胞使用倒置显微镜和HE染色可在一个视野里见到形态不同的几种细胞,部分呈圆形,体积较小,集落样重叠生长的;部分呈卵石样,形成环状结构的;其余的为梭形的细胞。爬片组分别进行骨钙素和vWF免疫细胞化学染色均为阳性,体视分析EC面密度为14.1%。透射电镜显示凝胶组(采用成骨诱导剂和EC诱导剂)的细胞以紧密连接形成环状结构,且腔内有微绒毛。凝胶上单独使用一种诱导剂的细胞只分别显示一种荧光,LSCM显示凝胶组的细胞同时表达两种抗原,在两种颜色混合后呈黄色,但有部分细胞颜色偏红色,而部分偏绿色。上述结果提示BMSCs在同一微环境下可以向两个方向同时分化。5采用液体替代法测得3D海藻酸钠凝胶孔隙率为91.14%,支架石蜡切片HE观察发现形态为多孔状,大部分孔隙类似于圆形,镜下可见多个大小不一,分布较为均匀的孔状结构;平均孔径长度为205.26±78.98μm。扫描电镜下,3D海藻酸钠凝胶表面粗糙,高低起伏,孔隙较多,孔与孔之间相互连通,孔径大小不一。提示3D海藻酸钠凝胶是一种较适宜的骨组织工程支架材料。6 BMSCs/ 3D海藻酸钠凝胶的细胞支架复合物移植到大鼠背部皮下组织后,X-ray追踪观察发现A组6w时出现散在钙化点,8w时可见大量钙化。B组至8w时出现散在钙化点。对照组(C组和D组)未发现钙化。组织块取出观察发现A组8w时钙化明显,可见从残留的凝胶里长出白色的物质,B组8w时可见散在钙化点;C组支架被机体吸收,仅余一些坏死组织。8w组织块HE染色,A组可见钙化点,丰富、HE染色为蓝色;软骨母细胞,胞浆染为红色;软骨前体细胞,已经向周围分泌了基质,且细胞外开始出现陷窝(软骨细胞的标志);血管较多,在钙盐沉积周围可见到丰富的原始血管腔。B组仅可见较少的钙盐沉积,可见软骨母细胞,但没有发现软骨前体细胞;可见血管,但图像分析系统分析两组血管面密度结果为B组少于A组。结论1培养板上的BMSCs表达成骨相关基因,我们认为BMSCs具有自发向成骨细胞分化的潜能。2通过检测2D海藻酸钠凝胶的细胞界面、降解、骨诱导性以及3D凝胶的孔隙率、孔径大小、孔之间的交通性以及BMSCs在凝胶上的增殖情况,我们发现BMSCs在凝胶上增殖良好;2D海藻酸钠凝胶的细胞界面粗糙,适于细胞的黏附;凝胶随着时间的延长逐渐降解;对BMSCs具有骨诱导性;3D凝胶孔之间具有交通性,且孔隙率和孔径大小也符合骨组织工程支架材料的要求,因此我们认为海藻酸钠凝胶是一种较适宜的骨组织工程支架材料。3在同一微环境中使用由成骨诱导剂和EC诱导剂混合而成的培养液同时作用于BMSCs,发现BMSCs可能具有在一个微环境中被诱导向两个方向分化的潜能。4使用混合培养液(成骨诱导剂和EC诱导剂)在体外诱导培养BMSCs/ 3D海藻酸钠凝胶复合物6d后,移植入Wistar大鼠体内,一段时间后,可观察到生成骨组织的早期阶段(软骨内成骨)以及血管的增生。因此我们认为诱导培养BMSCs/ 3D支架,使BMSCs同时向成骨细胞和EC分化后再移植入体内是构建血管化的组织工程骨的一种可行的方法。