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第一部分兔早期退变椎间盘来源NPSCs分离、培养和鉴定目的分离、培养和鉴定兔早期退变椎间盘髓核来源干细胞(NPSCs)。方法1)选取健康新西兰大白兔,通过针刺法诱导早期椎间盘退变模型。2)获取兔健康和早期退变椎间盘髓核组织,消化后,培养。3)鉴定所分离细胞表面标志物基因表达和多系分化潜能(成骨、成脂、成软骨)。结果1)针刺法可有效诱导兔椎间盘退变。2)兔早期退变椎间盘内髓核组织消化后,体外培养,能够观察到细胞贴壁,呈集落生长,原代细胞的形态多呈纺锤样或铺路石样;细胞传代培养后,可见细胞形态变为均一的铺路石样。3)所分离、培养P2代NPSCs表达间充质干细胞(MSCs)阳性标志物基因(CD166,CD44,CD29,不表达造血干细胞表面标志物基因(CD14,CD8,CD4);经诱导培养后,NPSCs可成骨、成脂、成软骨多系分化;同正常髓核组织中分离的NPSCs相比,早期退变椎间盘来源的NPSCs集落形成较少。结论兔早期退变椎间盘髓核组织可分离出呈集落样生长,表达MSCs阳性标志物,且具备多系分化潜能的干细胞(NPSCs);同健康椎间盘来源NPSCs相比,早期退变椎间盘来源NPSCs集落形成能力下降。第二部分P-PRP与L-PRP对早期退变椎间盘来源NPSCs增殖和分化的影响目的探讨去白细胞富血小板血浆(P-PRP)与含白细胞富血小板血浆(L-PRP)对早期退变椎间盘髓核来源干细胞(NPSCs)增殖和分化的影响。方法1)取P2代NPSCs,分别应用不同体积分数P-PRP与L-PRP进行培养(0%、5%、10%、15%和20%,Vol/Vol),检测最适NPSCs增殖的PRP体积分数,并比较P-PRP与L-PRP诱导NPSCs增殖差异(CCK-8法)。2)分别用P-PRP与L-PRP培养P2代NPSCs,应用实时定量荧光聚合酶链反应(q RT-PCR)测定各组细胞干性基因(Oct4和Nanog)、髓核相关基因(AGC和COL II)表达。3)分别用P-PRP与L-PRP培养P2代NPSCs,Westernblot检测AGC和COL II蛋白表达;免疫荧光检测各组细胞AGC和COL II蛋白表达。结果1)无论P-PRP还是L-PRP均可促进NPSCs增殖,在浓度为10%时细胞增殖率最大(P<0.05),且低于此浓度时呈现剂量依赖性。当P-PRP或L-PRP浓度为15%或20%时,细胞增殖率呈现下降趋势;各浓度P-PRP组细胞增殖率同L-PRP组细胞增殖率之间无统计学差异(P>0.05)。2)诱导后NPSCs干细胞基因(Nanog、OCT-4)表达显著下降,其中P-PRP组细胞干性基因表达下降最为显著(P<0.05)。诱导后NPSCs AGC和COL II基因表达显著增加,其中P-PRP组细胞基因表达最高(P<0.05)。3)Western blot和免疫荧光结果提示P-PRP组细胞AGC和COL II蛋白升高较为显著(P<0.05)。结论P-PRP与L-PRP均可促进兔早期退变椎间盘来源NPSCs增殖和向髓核细胞分化,两者促增殖能力类似,且10%浓度为最适增殖浓度;P-PRP诱导NPSCs成髓核细胞分化能力优于L-PRP。第三部分P-PRP与L-PRP对早期退变椎间盘来源NPS Cs分解代谢和炎症的影响目的探讨去白细胞富血小板血浆(P-PRP)与含白细胞富血小板血浆(L-PRP)对早期退变椎间盘髓核来源干细胞(NPSCs)分解代谢和炎症的影响。方法1)分别用P-PRP与L-PRP培养P2代NPSCs,应用实时定量荧光聚合酶链反应(q RT-PCR)测定分解代谢基因(MMP-1和MMP-13)和炎症基因(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)表达。2)分别用P-PRP与L-PRP培养P2代NPSCs,应用酶联免疫法(ELISA法)测定炎症因子TNF-α、IL-1β蛋白浓度。结果1)P-PRP及L-PRP均降低了分解代谢基因(MMP-1和MMP-13)和炎症基因(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)表达;同L-PRP组相比,P-PRP组分解代谢和炎症基因表达明显下降(P<0.05)。2)P-PRP及L-PRP组炎症因子蛋白(IL-1β、TNF-α)明显下降,其中P-PRP组最低(P<0.05)。结论同L-PRP相比,P-PRP能够更好的降低早期退变椎间盘来源NPSCs分解代谢及炎症反应。