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目的:NIRF蛋白是泛素化E3连接酶,通过构建各个表达质粒,包括真核表达质粒pFLAG-NIRF,原核表达质粒pGST-NIRF、pGST-HBc,并在HEK293细胞或E.coil BL21(DE3)中表达,纯化出GST-NIRF、GST-HBc蛋白;通过GST pull down证明NIRF与HBc在细胞外存在蛋白—蛋白相互作用;建立泛素化体系,探讨HBc(HBVcore protein)能否被NIRF蛋白泛素化。
方法:
(1)根据NIRF基因序列设计引物,NIRF基因经PCR扩增后连接到pMD19T上,经酶切连接后构建pGST-NIRF原核表达质粒;pGST-NIRF转化E.coil BL21(DE3),优化表达条件使GST-NIRF蛋白在上清中大量完整表达,并探索一条高纯度蛋白纯化方法用以获得GST-NIRF蛋白;用脂质体转染法将pCDNA3-HBc转染至HEK293细胞,检测其表达;纯化后的GST-NIRF蛋白与转染pCDNA3-HBc的细胞上清共同孵育,经GST pull down证明2者之间是否存在相互结果。
(2)根据HBc基因序列设计引物,HBc基因经PCR扩增后连接到T载体pTArget上,经酶切连接后构建pGST-HBc原核表达质粒;pGST-HBc转化E.coil BL21(DE3)经优化表达条件后纯化出GST-HBc蛋白;设计NIRF基因引物,基因经扩增后插入到p3*FLAG-CMV-10中构建pFLAG-NIRF质粒;脂质体转染法将pFLAG-NIRF转染至HEK293细胞,检测其表达;纯化后GST-HBc蛋白与转染pFLAG-NIRF的细胞上清共同孵育,经GST pull down证明2者之间是否存在相互结合。
(3)纯化后的GST-NIRF、GST-HBc蛋白用以构建细胞外泛素化体系,分别作为泛素化E3连接酶及泛素化底物。泛素化反应完成后,产物通过SDS-PAGE分离,蛋白免疫印迹检测是否有泛素化条带产生,从而确定NIRF是否能泛素化HBc。
结果:
(1)成功构建pGST-NIRF原核表达质粒并在E.coil BL21(DE3)顺利表达,优化表达条件得到GST-NIRF在细胞上清中的大量完整表达,探索出一条GST-NIRF蛋白的纯化方式获得较高纯度的GST-NIRF全长蛋白,为蛋白相互作用鉴定及泛素化反应奠定基础;通过GST pull down证明NIRF与HBc能够在细胞外相互结合。
(2)成功构建pGST-HBc原核表达质粒并在E.coil BL21(DE3)顺利表达,优化表达条件得到GST-HBc较高浓度表达,纯化出高浓度的GST-HBc蛋白;成功构建pFLAG-NIRF真核表达质粒,并在HED293细胞中顺利表达;通过GST pull down证明HBc与NIRF能够在细胞外相互结合。
(3)体外泛素化结果提示,HBc可能被NIRF泛素化。HBc抗体检测效果不理想,无法准确判定还需进一步实验证明。
结论:GST pull down证明NIRF蛋白及HBc能够在细胞外相互结合;泛素化结果表明,NIRF蛋白有可能泛素化HBc蛋白,证据不充足还有待进一步完善,另此结果只能为NIRF对HBc的泛素化作用提供体外证据。