【摘 要】
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禽坦布苏病毒(Tenbusu,TMUV)是禽坦布苏病毒病的主要病原。该病2010年4月首先在我国东南沿海养鸭场爆发,受感染后病鸭产蛋量骤降、采食量下降,剖检病鸭可见病鸭卵巢出血、炎症、
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禽坦布苏病毒(Tenbusu,TMUV)是禽坦布苏病毒病的主要病原。该病2010年4月首先在我国东南沿海养鸭场爆发,受感染后病鸭产蛋量骤降、采食量下降,剖检病鸭可见病鸭卵巢出血、炎症、萎缩。随后研究中亦在鹅、鸡和麻雀中分离到该病毒。坦布苏病毒病的流行给养鸭业造成了巨大的损失。 本文根据从30份临床病料中分离鉴定了7株坦布苏病毒,并分别命名为NJ110417、NJ120807、NJ120812、NJ1208、YY2、JSg(鹅源)、WZ1302。分离的病毒不能凝集鸡、鼠、人等红细胞。将分离到的病毒接种SPF鸡胚后,鸡胚出现死亡,死亡鸡胚胚体通红出血,鸡胚尿囊液浑浊,有尿酸盐沉淀。分离病毒接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞后,细胞出现病变,表现为圆缩脱落。根据已登录报道的坦布苏病毒序列,针对其保守NS5序列,设计了一对引物,建立了RT-PCR方法,该方法特异、敏感,而且能从临床病料中直接检测到坦布苏病毒的核酸。 根据已发布的坦布苏病毒的全基因组序列,设计引物,扩增坦布苏病毒核酸的各个区域,PCR产物测序、拼接最终获得了YY1、JSg和YY2三株坦布苏病毒分离株的全基因组序列。序列分析结果显示三株坦布苏病毒分离株同源性较高,2010年分离株YY1和2012年分离株YY2全基因组水平同源性为99.5%,与JSg同源性为99.7%; YY1与其他黄病毒毒株的比较中,与MM-175和Sitiawan同源性分别为96.5%和97%,与Bagaza和Nataya毒株的同源性分别为79.9%和79.7%,表明该三株毒株与黄病毒科病毒有较高的同源性。而且在鸭和鹅分离株间,以及不同发病高峰期分离株之间具有高度的同源性。 最后本研究对坦布苏病毒抗体检测方法进行了研究,即建立了基于全病毒包被的ELISA检测方法。全病毒包被ELISA条件进行优化,获得最佳的ELISA检测程序为Tris-HCl缓冲液稀释抗原至6μg/mL,4℃过夜包被抗原,2%脱脂奶封闭,1∶200稀释待检测血清,37℃孵育1h,1∶1000稀释HRP羊抗鸭,37℃孵育1h,TMB底物37℃反应5min后终止反应,读取OD450数值。当OD450值≥0.317时判定为阳性,OD450值<0.317时判定为阴性。分别用全病毒包被ELISA和IFA检测33份临床鸭血清,结果显示,全病毒包被ELISA检测方法与IFA相比,阳性符合率为95.45%,阴性符合率为81.81%,总符合率为90.9%。
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