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研究目的本实验通过研究蝎毒抗癌多肽（PESV）对肺癌A549干细胞样细胞增殖、凋亡、干性的影响,以及对荷瘤裸鼠抗肿瘤作用的研究,探讨蝎毒抗癌多肽抑制肺癌的作用机制,为靶向治疗肺癌和开发新型治疗药物提供理论基础。研究方法1.A549细胞培养A549细胞培养于含10%FBS的RPMI1640完全培养基中,放置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养,等到细胞长到80%的汇合度时,用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶进行消化,常规传代。2.悬浮细胞球培养和肺癌A549干细胞样细胞鉴定（1）A549细胞球培养。配制无血清培养基,DMEM/F12培养基中添加20 ng/ml EGF、20 ng/ml b-FGF和2%B27。将A549细胞种植于含无血清培养基的超低吸附培养板里,然后放置于培养箱内进行培养,每隔3 d进行半量换液,倒置显微镜下观察细胞成球情况。（2）收集普通培养和无血清条件培养的A549细胞,用流式细胞仪检测肺癌干细胞表面标记物CD133和ALDH1A1标记细胞的比例。3.实验分组将培养好的A549细胞分为空白对照组（Control）、蝎毒抗癌多肽（PESV）组和Notch1抑制（DAPT）组。4.肺癌A549干细胞样细胞增殖、凋亡和干性的检测（1）MTT法和细胞克隆实验检测PESV对肺癌A549干细胞样细胞增殖能力的影响;（2）流式细胞仪检测PESV对肺癌A549干细胞样细胞凋亡率的影响;（3）细胞成球实验检测PESV对细胞干性的影响;5.肺癌A549干细胞样细胞增殖、凋亡和干性相关基因的检测Western blotting法检测肺癌A549干细胞样细胞增殖、凋亡相关基因PCNA、Bcl-2和干性相关基因ALDH1A1、Sox-2、Snail、Musashi 1、Notch1、Hes-1蛋白表达水平的变化。6.荷瘤裸鼠肿瘤的测定6～8周雄性荷瘤裸鼠皮下接种细胞一周后,随机分为空白对照组（Control）、蝎毒抗癌多肽（PESV）组和Notch1抑制（DAPT）组,每组6只。PESV组灌胃用药20 mg/kg,DAPT组腹腔注射给药10 mg/kg,Control组灌胃相同体积的生理盐水,连续给药5周,每2 d测量肿瘤体积一次,用游标卡尺分别测量肿瘤的长径和短径,并使用公式V=1/2（短径～2×长径）计算肿瘤体积。皮下接种细胞6周后,颈椎脱臼法处死小鼠并称重肿瘤块,记录肿瘤块的重量。7.荷瘤裸鼠肿瘤增殖、凋亡和干性相关基因的检测采用免疫组化、免疫荧光和Western blotting法检测肺癌A549干细胞样细胞增殖、凋亡相关基因PCNA、Bcl-2蛋白表达,干性相关基因ALDH1A1、Sox-2、Snail、Musashi1、Notch1、Hes-1蛋白表达水平的变化。实验结果1.复苏过程中A549细胞形态学观察在倒置显微镜下观察刚刚复苏的A549细胞,此时A549细胞呈现圆形透亮的状态并且悬浮于培养基中,然后将细胞放置于37℃,5%CO2细胞培养箱进行培养,过夜,此时大部分细胞贴壁生长,用PBS清洗未贴壁细胞并进行换液,观察到细胞的形态呈现梭形,随着培养时间的延长,细胞呈梭形或多角形。2.肺癌A549干细胞样细胞的鉴定通过无血清培养获得A549细胞球,流式细胞仪检测肺癌干细胞表面标记物CD133和ALDH1A1标记的细胞比例结果表明,无血清培养的A549细胞中表达CD133和ALDH1A1细胞的比例明显高于普通培养的A549细胞（P<0.01）。3.Notch1在普通培养和无血清培养A549细胞中的表达差异qRT-PCR和Western blotting法检测结果表明,无血清培养的A549细胞中Notch1基因表达明显高于普通培养的A549细胞（P<0.01）,实验结果说明Notch信号通路中Notch1在肺癌A549干细胞样细胞中发挥重要作用。4.PESV对肺癌A549干细胞样细胞的影响研究（1）PESV对肺癌A549干细胞样细胞增殖、凋亡的影响MTT法和细胞克隆实验表明,PESV组和DAPT组细胞的增殖能力明显低于Control组细胞,PESV组和DAPT组细胞的凋亡率明显高于Control组细胞;Western blotting法检测结果表明,PESV组和DAPT组细胞中增殖、凋亡相关基因PCNA、Bcl-2和Notch1、Hes-1的蛋白表达量明显低于Control组细胞,差异均具有统计学意义（P<0.01）。实验结果说明PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1的表达,抑制肺癌A549干细胞样细胞的增殖能力,并且能够促进其凋亡。（2）PESV对肺癌A549干细胞样细胞干性的影响细胞成球实验结果表明,PESV组和DAPT组A549细胞成球大小和成球数量均明显低于Control组细胞;Western blotting法检测结果显示,PESV组和DAPT组细胞中干性相关基因ALDH1A1、Sox-2、Snail、Musashi 1蛋白表达量均明显低于Control组,差异均具有统计学意义（P<0.01）。结果提示,PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1的表达,抑制肺癌A549干细胞样细胞的成球能力,降低其干性。5.PESV对荷瘤裸鼠肿瘤的影响研究（1）PESV对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响实验结果表明,PESV可明显降低异种移植瘤的大小和肿瘤重量,同时明显降低Notch、Hes-1、PCNA、Bcl-2蛋白表达,差异均具有统计学意义（P<0.01）。实验结果说明,PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1的表达,抑制A549荷瘤裸鼠肿瘤的生长。（2）PESV对荷瘤裸鼠肿瘤细胞干性的影响Western blotting法和免疫荧光检测结果表明,PESV可明显降低荷瘤裸鼠肿瘤细胞中肿瘤干细胞相关基因Sox-2、Musashi 1、Snail、ALDH1A1蛋白表达,差异均具有统计学意义（P<0.01）。实验结果说明,PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1的表达,抑制A549荷瘤裸鼠肿瘤中干性相关基因的表达。实验结论1.通过无血清培养获得A549细胞球,用肺癌干细胞表面标记物CD133和ALDH1A1标记的细胞比例明显升高,可以得到肺癌A549干细胞样细胞。2.PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1表达抑制肺癌A549干细胞样细胞增殖并促进其凋亡。3.PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1表达抑制肺癌A549干细胞样细胞成球大小和成球数目,降低肺癌A549干细胞样细胞干性。4.PESV能够通过下调Notch1及其下游基因Hes-1表达抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,降低肺肿瘤细胞的干性能力。