维吾尔药罗勒子化学成分及其生物活性研究

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罗勒(Ocimum basilicum L.),为唇形科罗勒属植物中的一种,在我国包括栽培在内共5种,3个变种。罗勒子为罗勒的干燥成熟果实,记载于中华人民共和国卫生药品标准“维吾尔药分册”,是维吾尔族民间常用药材之一。大量文献显示,目前为止,前人对罗勒子的研究主要集中在对种子的培育、生长过程的影响因素及其杀虫作用等方面,虽然印度科研人员对罗勒子粘液质的多糖进行了酸性多糖的分离和单糖组成分析,但由于研究年限过早、研究手段简单,单糖组成及其含量分析并不全面,而且对其脂肪酸、挥发油和其它化学成分及生物活性等方面的研究还相当欠缺,国内外研究基本空白,其活性成分和作用机理尚不明确,药材指标成分的选择缺乏科学依据,造成其质量标准低,亟待提高。  为了寻找其有效成分和科学食用方法,揭示其抗氧化和降血糖等作用的物质基础,本论文以新疆罗勒子为研究对象,采用抗氧化、抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)等活性筛选为导向的研究手段,对新疆罗勒了中水溶性、碱溶性和酸溶性多糖进行了系统的提取分离和纯化研究,结合阴离子交换树脂、分子排阻色谱等现代分离分析技术,对新疆和田产罗勒子酸性多糖成分进行进一步的分离纯化和结构特征研究,采用高效薄层色谱-质谱连用技术、毛细管电泳等技术分析多糖提取物单糖组成,并考察了酸性多糖的抗氧化和降糖生物活性,同时建立了罗勒子脂肪酸成分的超临界二氧化碳提取工艺,为罗勒子资源的综合利用提供了科学依据,主要研究内容如下:  1.罗勒子脂肪酸成分提取工艺研究及其蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制作用  本研究通过索氏提取、微波提取和超临界二氧化碳提取等现代提取工艺技术,对罗勒子的脂肪酸成分进行了系统的提取工艺研究,确定了最佳提取工艺,同时利用气相色谱质谱(GC/MS)仪鉴定出脂肪酸的主要化学成分的类型,并评价其食用价值和体外蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制作用;  研究结果证实,索氏提取方法罗勒子出油率为14%,其中α-亚麻酸为62.88%、亚油酸为20.66%、棕榈酸为10.67%、硬脂酸为5.79%为四个主要脂肪酸组成成分;超临界二氧化碳提取脂肪酸最佳工艺为,提取压力300 bar,提取温度40℃,提取时间4小时,在此工艺条件下提取的罗勒子油颜色明亮清晰品质好,出油率可达17.05%,其中不饱和脂肪酸成分含量达到85%;微波协助提取方法罗勒子脂肪酸的最佳提取工艺为:提取温度为40℃,微波功率为400 w,提取时间为6分钟,此方法罗勒子出油率为25.8%其中不饱和脂肪酸含量达到88.41%;  研究证实,罗勒子油脂的酸值为41.97,碘值为36.26,皂化值为156.17,各参数均在中华人民共和国药典指定的范围内,因此证明罗勒子油脂可作为食用油;对罗勒子脂肪酸进行PTP1B的抑制作用研究,结果表明脂肪酸对PTP1B有较强的抑制作用,其IC50为11.12μg/mL。  2.罗勒子挥发油成分及抗氧化活性研究  通过水蒸气蒸馏法提取了新鲜采集罗勒子中的挥发油,并采用GC-MS仪器鉴定出以亚麻油酸(13.83%)、正棕榈酸(13.80%)、长叶薄荷酮(8.31%)、反式斯巴醇(6.72%)等四个化合物为主的60种化学成分;新疆罗勒子挥发油与不同产地罗勒子挥发油成分对比结果显示,新疆罗勒子挥发油化合物类型以酸、酮、醇等为主;而且由于罗勒的产地、采收季节、提取方法、甚至储藏等条件不同,所提取的罗勒挥发油的主要成分也不同。  通过抗氧化活性测定(清除DPPH自由基能力)证明了罗勒子挥发油具有较好的清除DPPH自由基的作用,其抑制率与浓度成正比。  3.罗勒子多糖的提取分离、制备及其单糖组成研究  在这项研究中,连续提取和纯化方法制备了水溶性多糖(WSPS-C)、热水溶性多糖(WSPS-H)、半纤维素(HC)、果胶(PS)、热水溶性酸性多糖(WSPS-H-A)和半纤维素酸性多糖(HC-A)等6种多糖提取物,对其理化性质分析结果表明,罗勒子粗多糖提取物都是糖蛋白缀合物,经测定,其中WSPS-C中性糖含量为76.5%,糖醛酸含量为9.3%,蛋白质含量为8.0%;WSPS-H中性糖含量为67.3%,糖醛酸含量为21.3%,蛋白质含量为9.0%;HC中性糖含量为43.4%,糖醛酸含量为16.2%,蛋白质含量为17.0%;PS中性糖含量为43.2%,糖醛酸含量为41.3%,蛋白质含量为1.4%;它们至少含有9.3%的糖醛酸成分。  利用高效薄层层析技术(HPTLC),以乙酸异丙酯-醋酸乙酯-甲醇-水5∶4∶1∶0.1(v/v/v/v)为展开剂,并在370或630 nm光密度定量测定方法,对罗勒子6种多糖提取物进行其单糖成分的定性和定量分析。结果显示,罗勒子多糖主要由果糖(HRF80),葡糖醛酸(HRF58),半乳糖醛酸(HRF51),鼠李糖(HRF40),木糖(HRF25),阿拉伯糖(HRF18)和半乳糖(HRF9)等7种单糖组成,其中木糖、葡萄糖醛酸和果糖为主要组成成分,它们在总多糖的百分含量分别为45%、31%和21%。所有的提取物含有糖醛酸,其范围在3-24%;研究中在葡糖醛酸上面发现一个未知的化合物,并采用HPTLC-UV/Vis-MS技术,确定其为葡萄糖醛酸异构体。  同时,建立了柱前衍生-高效毛细管电泳分析罗勒子水溶性总多糖的方法,并测定了罗勒子水溶性多糖中的葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸和半乳糖等7种单糖组成的含量,研究结果表明,其单糖组成的摩尔比分别为3.54∶2.56∶1.56∶0.46∶0.21∶0.99∶0.12。生物活性筛选结果表明,罗勒子总多糖提取物WSPS-C、 WSPS-H、PS和HC都具一定的降糖活性,它们体外具有较强的抑制PTP1B活性,它们的IC50值为分别为8.2,2.2,70.9和0.8μg/mL,其中半纤维素总多糖的降糖活性为最强IC50=0.8μg/mL。  通过进一步文献查阅和结合单糖组成研究结果,推断罗勒子酸性多糖的连接键型;推断罗勒子多糖含有(1→4)链接的木聚糖主链携带的分支点,在C-2和C-3的木糖残基,并显示的侧链的结构特征。  4.罗勒子酸性单体多糖的分离、纯化、制备及其结构特征研究  采用离子交换树脂、凝胶渗透和分子排阻色谱(Sephadex G-100)等分离纯化技术对罗勒子热水溶酸性级分多糖部位(WSPS-H-A),进行其单体多糖成分的分离、纯化和制备,并首次从罗勒子中分离得到了LLZ-Hot-200-0.2-15.2-G-Ⅰ、LLZ-Hot-200-0.2-15.2-G-Ⅱ、 LLZ-Hot-200-0.2-23-G、LLZ-Hot-200-0.2-32.6-G、LLZ-Hot-200-0.2-25.6-G; LLZ-Hot-200-0.5-Ⅰ-G-Ⅰ、 LLZ-Hot-200-0.5-Ⅰ-G-Ⅱ、LLZ-Hot-200-0.5-Ⅱ、 LLZ-Hot-200-0.5-Ⅲ;LLZ-Hot-200-1.0-Ⅰ、LLZ-Hot-200-1.0-Ⅱ等15个单体酸性多糖成分,其中9个单体化合物结构用核磁共振(NMR)、红外(IR)、紫外(UV)和LC-MS的等光谱技术进行了分析,并总结了罗勒子多糖的结构特征。采用紫外和红外光谱分析考察其结构表明,罗勒子酸性单体多糖都是非糖蛋白缀合物(多糖仪没有紫外吸收);从罗勒子的中红外光谱结构分析看出,醇羟基的基频是在3409-3437cm-1左右,峰形尖锐的吸收峰是OH的伸缩振动吸收峰;2923 cm-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰,1645cm-1处的吸收峰是OH的弯曲振动吸收峰;核磁共振氢谱1H NMR分析结果显示,糖环碳上大部分质子的化学位移由于受羟基的屏蔽作用而位于3~4 ppm范围内,信号重叠严重,解析困难;核磁共振碳谱13C NMR分析结果显示,罗勒子酸性多糖的化学位移范围较1H NMR广,达200 ppm,具有较好的分辨率。
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