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大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann& Gerdemann)。引起的一种危害严重的土传病害。这种病害可以导致受害大豆产区高达40%的损失,甚至可能导致大豆产区绝产。大豆疫霉隶属卵菌门,在形态上与丝状真菌比较相似,但是在进化的角度来说,它与真菌相差甚远,和藻类同属于茸鞭生物界,所以它的致病机理跟其他真菌差别很大,目前国内外有关大豆疫霉菌致病机理的研究尚比较少。
本论文以大豆疫霉菌低毒力菌株P7364L为研究材料,将其与大豆疫霉菌标准菌株P6497做比较,测定和比较了它们的致病力、菌落生长速率、产孢量、休止率、萌发率以及孢子囊产量,发现P7364L与P6497在菌落生长速率、产孢量、休止率等表型上无明显差异,但是P7364L的孢子囊产量和游动孢子产量明显低于P6497。在相同游动孢子浓度下,用游动孢子接种感病大豆幼苗Williams下胚轴,发现P7364L的致病力明显低于标准的大豆疫霉菌P6497;取侵染后不同时间点的大豆下胚轴表皮进行Trypan blue染色,在显微镜下观察和比较P7364L与P6497的侵染情况,发现P7364L虽然能正常产生附着胞并成功侵入大豆表皮细胞,但不能在其细胞内正常扩展。
为进一步研究P7364L致病力下降的原因,利用先进的Solexa高通量全转录组测序技术和Real-Time RTPCR技术,找到了一批可能与致病力相关的基因。本研究中分别提取P7364L和P6497在菌丝阶段、产游动孢子囊孢阶段、侵染1.5小时、侵染6小时、侵染12小时的RNA,反转录后合成cDNA,并用于后续的Real-Time RTPCR和Solexa全转录组测序工作。Real-Time RTPCR和Solexa结果均显示在P.infestans中已经证实的游动孢子囊形成调控基因cdc14和NIFS在本研究的低毒力菌株P7364L中显著下调,两个可能与产孢相关的cAMP依赖的蛋白激酶基因也有显著下调的现象,这些结果一方面解释了P7364L产孢子囊显著减少的原因,另一方面表明本实验中的研究材料和方法具有很高的可信度。
通过分析和统计Solexa结果,发现P7364L中有830个基因显著下调,有85个基因显著上调,其中包括一些已经证实的致病相关因子如Cystatin类和Kazal类胞外酶抑制子、以及细胞壁合成相关的纤维素酶以及几丁质合酶、在真菌中与致病因子外泌密切相关的Hsp90家族的KAR2与LHS1。同时还发现P7364L中显著下调的基因中多为一些蛋白激酶、转录因子、以及一些外泌相关基因,提示P7364L的低侵染力很可能与信号传导、外泌调控等过程是紧密联系的。本论文的研究工作也为下一步找寻新的大豆致病相关基因奠定了基础,进而为开发新型杀菌剂提供有效的靶标位点。