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目的利用小干扰RNA干预体外培养的大鼠心肌细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的生成,探讨其对在模拟心肌缺血再灌注损伤时在缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)损伤方面对心肌细胞功能的修复,以及HIF-1α的变化对下游靶基因水平的影响,在临床治疗和预防患者的心肌梗死患方面提供心肌缺血再灌注损伤相关的治疗新思路。方法(1)取1-2天的SD乳鼠心肌细胞进行原代培养,雌雄随机,对分离纯化的心肌细胞进行形态学方面的观察和鉴定,选取介入模拟缺氧复氧条件时细胞自发生长的最佳时间,设计并构建乳鼠的心肌细胞体外缺氧/复氧(H/R)模型(2)设计并建立缺氧复氧模型,将分离纯化后已培养第3至4天的SD乳鼠原代心肌细胞等量随机分成3组,具体分组方式为:①正常对照组(质量控制及对照Control组);②缺氧/复氧(H/R)组;③siRNA转染后的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(P4HA2·siRNA H/R)组;(3)缺氧复氧模型构建完成后,将培养好的各组心肌细胞分别置于倒置显微镜下,进行细胞形态学方面的观察和计数,包括计数各分组细胞的搏动频率、存活率以及各分组心肌细胞在形态学方面的变化;检测心肌细胞的增殖情况,形态改变情况以及存活率变化(MTS法);(4)构建并鉴定P4HA2小干扰RNA(siRNA),制备慢病毒载体,转染大鼠心肌细胞;(5)采用SYBR Green荧光定量PCR法扩增,检测HIF-1α在各组心肌细胞缺氧复氧模型中的表达水平;用化学发光法检测各组心肌细胞的特异性损伤指标肌钙蛋白I(cTnI)的含量;采用SYBR Green荧光定量PCR法检测下游靶基因VEGF、GLUT-1和HO-1mRNA表达水平。统计分析使用SPSS19.0软件,采用One-Way ANOVA分析比较组间数据,两两比较方差分析采用LSD方法。结果(1)接种四到六个小时左右后心肌细胞开始贴壁生长,约十五到二十四小时后贴壁的心肌细胞开始多呈梭形、菱形及多角形,并出现节律性自发性的搏动(2)在倒置显微镜下观察到的新鲜分离的大鼠心肌细胞呈球形,四到八小时后心肌细胞开始贴壁生长融合,呈不规则椭圆形和梭形,三十二小时左右大多数细胞呈现为放射状排列的细胞簇,胞浆逐渐丰富,细胞核变大,七十二小时后心肌细胞呈不规则形态,并伸出伪足,逐渐连接成网状交织的细胞单层,折光性增强并出现同步化搏动,收缩频率稳定且有力,至第4天搏动达高峰,搏动频率为90~120/min,第五第六天此状态在稳定培养条件下可保持,从第7天起原代细胞开始逐渐衰亡,搏动频率逐渐减少且频率不稳定,此后细胞开始逐渐皱缩,胞浆出现粗大颗粒和空泡,证明细胞衰亡。(3)H/R模型成功建立(4)构建并鉴定P4HA2小干扰RNA,确定siRNA的有效靶点,制备慢病毒载体,转染乳鼠原代心肌细胞,建立转染后的心肌细胞H/R模型(5)①关于各组心肌细胞搏动频率及存活率的两两比较:H/R组与正常control组比较明显降低,转染细胞H/R组与正常control组比较明显升高,H/R组与转染细胞H/R组相比明显降低(P<0.05);②关于各组细胞肌钙蛋白I的含量的两两比较:H/R组与正常control组比较明显升高,转染细胞H/R组与正常control组比较明显降低,H/R组与转染细胞H/R组相比明显升高(P<0.05);③关于各组心肌细胞内缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转运体-1(GLUT-1)以及血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA的表达水平两两比较:H/R组与正常control组比较明显降低,转染细胞H/R组与正常control组比较明显升高,H/R组与转染细胞H/R组相比明显降低(P<0.05)结论HIF-1α因子通过调节下游靶基因,可以达到保护缺氧复氧损伤的心肌细胞的作用;心肌细胞中HIF-1α的含量在利用P4HA2·siRNA慢病毒载体转染后,可以在未出现缺氧条件时达到总体水平的升高,并能有效调节多种下游靶基因含量升高,因此可以得出结论,即利用P4HA2小干扰RNA控制HIF-1α的含量变化,能够有效预先参与保护缺氧复氧损伤的心肌细胞,以最终达到预防或降低缺血再灌注时心肌细胞受到的不良影响。