粮食高产、优质是植物基础科学和应用科学研究的两个最重要目标。在水稻(Oryza sativa L.)等很多禾本科作物中,种子大小是由粒长、粒宽、粒厚和谷粒充实度共同决定的,是千粒重最主要的决定因素,也是谷粒产量三大决定因素中遗传力最高的因素；水稻种子大小不仅是一个重要的产量性状,而且还是一个非常重要的品质性状,它影响谷粒的长宽比和垩白率等外观品质、加工品质和蒸煮食味品质；另外,种子大小也是作物驯化和人工育种的靶标性状,为研究作物进化和驯化进程提供了一个很好的模式系统。稻米垩白会极大地影响稻米的外观品质、加工品质、蒸煮食味品质和营养品质,是稻米品质中最重要的品质性状。近年来,虽然控制垩白的QTL基因还没有被克隆,但很多控制种子大小和重量的QTL基因均已被图位克隆,并且它们均是负调控种子大小的基因。在本研究中,我们分离克隆并功能研究了位于水稻第5染色体短臂上的一个正调控种子大小和重量的微效QTL基因GS5,以及一个正调控稻米垩白率的主效QTL基因Chalk5。本研究主要结果如下：1.通过固定qSW5为小粒等位基因型,重新构建了以珍汕97为背景的GS5QTL近等基因系NIL(ZS97)和NIL(H94)。与NIL(H94)相比,NIL(ZS97)在粒宽和千粒重上分别增加了8.7%和7.0%,继而导致单株谷粒产量增加7.4%。来自宽粒品种珍汕97的等位基因在GS5QTL位点为显性。灌浆过程中NIL(ZS97)的谷粒充实速率显著高于NIL(H94),表明GS5对千粒重和单株产量的增加主要源于其对粒宽的增加和对谷粒充实速率的提高。因此,用粒宽作为靶性状来研究该GS5微效QTL位点。2.为了精细定位微效GS5QTL,从包含9638株的遗传分离群体中筛选到了足够多的重组单株,每个重组单株进行后代测验以确定其表型,综合分析重组单株各标记基因型和其后代测验所得到的目标基因的基因型,最终把GS5QTL精细定位至两个分子标记RM574与S2之间的11.6kb区域,两端分别有3个和4个重组单株支持该定位结果,并与InDel标记C62共分离。在该11.6kb范围内只有一个ORF,并有一条全长cDNA支持,因此,把它作为GS5QTL唯一的候选基因。该基因有10个外显子,编码一个属于S10家族的丝氨酸羧肽酶,含有一个保守的PF00450结构域。3.超表达窄粒GS5的转基因植株的谷粒宽度和千粒重各增加了8.2%和15.6%；T1代共分离分析表明粒宽与GS5的表达量呈显著正相关,较高的GS5表达水平可以产生较宽的种子,表现出一种剂量效应。表明GS5编码区的突变不是两等位基因粒宽变异的原因。因此,GS5调控序列的突变很可能是控制种子大小变异的主要因素。为了验证该假说,我们构建了宽粒品种珍汕97自身启动子驱动窄粒H94CDS的转基因载体。结果发现阳性转基因植株的粒宽和千粒重明显高于阴性植株,分别增加了6.2%和12.8%。Tl代共分离检测分析表明,粒宽和GS5的表达量呈显著正相关,较高的GS5表达水平可以产生较宽的种子。GS5的两种转基因植株在增加粒宽的同时并不影响植株的形态、抽穗期和谷粒的垩白率,为GS5转基因的应用打下了基础。另外,gs5T-DNA插入突变体的谷粒宽度和千粒重显著减少,分别减少了13.5%和16.8%,且该表型与基因型及其表达量共分离。这进一步证明GS5即为控制粒宽的GS5QTL基因。同时表明,宽粒品种珍汕97的自身启动子不仅可增强GS5的表达,还可增加种子的宽度,即GS5启动子区的自然变异是该QTL遗传变异的主要原因。4.GS5双亲比较测序发现,窄粒品种H94和明恢63的等位基因序列完全一样；与窄粒序列相比,宽粒品种珍汕97等位基因序列共有26处多态性变异,其中18处变异发生在翻译起始位点上游2.0kb的启动子上,这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型；8处变异发生在编码区,珍汕97等位基因翻译起始位点下游10至15bp处有一个大的6bp插入,在预测的信号肽上插入了两个氨基酸：下游编码区上还有3个SNPs变异,导致3个氨基酸发生了替换；内含子上有4处SNPs突变。5.对51份自然群体材料的GS5启动子区进行了比较测序和进化树分析。35份栽培稻的序列主要分成三种单倍型：H94单倍型(窄粒型,8份)、珍汕97单倍型(中宽粒型,13份)和中花11单倍型(宽粒型,14份),它们各自单倍型的序列完全一样。其中H94单倍型与珍汕97单倍型和中花11单倍型间分别有18处和22处变异,珍汕97单倍型与中花11单倍型间共有26处变异,并且这三种单倍型正好把粒宽分成明显的三组,表明GS5基因或者与其紧密连锁的qSW5基因在自然群体中可以解释很大的遗传变异。6份来源不同的普通野生稻序列和窄粒型H94单倍型的完全一样,属于H94单倍型；只有一份普通野生稻(IRGC103823)的序列和珍汕97单倍型的最相近,两者间只有两个SNPs变异；而其它8份普通野生稻没有归属到上述任何一种单倍型中。所有这些结果表明,H94单倍型的等位基因是野生型的,珍汕97单倍型和中花11单倍型均是在水稻人工驯化过程中发生的功能获得性突变型。6.GS5启动子缺失转化分析表明,从-1241到-1009的233bp区域中的4个SNPs很可能是GS5两个等位基因差异表达的原因,进而是GS5QTL的功能性遗传变异。7. GS5两近等基因系NIL(ZS97)和NIL(H94)的时空比较表达谱分析表明,GS5基因在各个组织中的表达量变化很大,无时间和组织的特异性；珍汕97等位基因在8cm幼穗和见穗前5天、4天、2天的颖壳以及受精后10天的胚乳中的表达量均高于H94,表明GS5两等位基因间的这种表达差异与粒宽、谷粒充实的关键发育时期是相一致的。RNA原位杂交分析显示,GS5在种子萌发后7天的茎顶端分生组织及幼叶、二次枝梗原基时期的小花、8cm幼穗时期的颖壳、受精后15天左右的胚乳中有较强的表达信号,这些表达部位与GS5引起种子大小变化的位置是一致的。在拟南芥原生质体中的比较亚细胞定位表明,GS5两蛋白均与内质网特异的标记蛋白Bip共定位,因此信号肽的两个氨基酸缺失变异并不影响两蛋白在细胞中的定位。8.GS5两NILs的颖壳切片分析可知,与NIL(H94)相比,NIL(ZS97)拥有较多的内稃细胞(+18.1%)、较多的外稃细胞(+21.2%)和较多的总细胞数目(+20.1%)；NIL(ZS97)的内稃细胞比NIL(H94)的大21.3%,而两者间的外稃细胞大小没有明显差异,从而使得NIL(ZS97);总的细胞大小比NIL(H94)的稍大10.5%。因此,细胞数目的改变应该是影响颖壳大小和种子大小的主要原因。9.25个细胞周期核心调控基因以及12个BR相关基因的差异表达分析表明,只有5个细胞周期G1/S期基因(CDKA1、CAK1、CAK1A、CYCT1和H1)的转录水平在GS5超表达材料中均明显上升、并在突变体中均明显下降,而其它32个基因在两个材料中没有这种明显的变化趋势。因此,GS5很可能处在细胞周期核心调控因子的上游、并通过正调节G1/S期基因的表达水平来调节细胞分裂。10. Chalk5主效QTL近等基因系随机小群体分析表明,来自高垩白(腹白)品种珍汕97的等位基因在Chalk5QTL位点是显性的。为了精细定位Chalk5QTL,利用9638株近等基因系F2代遗传分离群体,最终把Chalk5QTL精细定位至两个分子标记C181与C35之间,约16.8kb,两端均有3个重组单株支持该定位结果。在该16.8kb范围内只有两个ORF,其中一个在胚乳中有组织表达特异性,把它作为Chalk5QTL可靠的候选基因,该基因有4个外显子,编码一个液泡H+焦磷酸酶(V-PPase)。11.为验证该基因功能,利用高腹白率品种珍汕97的Chalk5做了互补转化实验,结果发现阳性转基因植株的腹白率明显高于阴性的,增加了26.6%；T1代和T2代共分离检测验证了该转基因的表型效应。超表达高垩白Chalk5的转基因也增加了18%的腹白率；T1代和T2共分离检测分析表明腹白率和Chalk5的基因型基本共分离。同时,这两个转基因的转录水平与腹白率高度共相关。这些结果均证明该ORF即为控制腹白率的Chalk5QTL基因,并且说明Chalk5是一个正调控腹白率的基因。12. Chalk5的两种转基因及NIL(ZS97)在增加垩白的同时严重降低了稻米的整精米率、总蛋白含量、千粒重和容重,增加了直连淀粉含量和胶稠度,说明Chalk5不仅控制稻米的外观品质,还普遍影响加工品质、蒸煮食味品质和营养品质及千粒重。13.比较测序发现,低垩白品种H94和明恢63的Chalk5等位基因序列完全一样；与H94和明恢63的等位基因序列相比,高垩白品种珍汕97等位基因序列发生39处多态性变异,其中10处变异发生在翻译起始位点上游1.8kb的启动子上,这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型,其中在珍汕97翻译起始位点上游约1kb处有一12bp大的缺失；5处变异发生在显子上,但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换；内含子上有24处SNPs突变。14. Chalk5两近等基因系NIL(ZS97)和NIL(H94)的时空比较表达谱分析表明,两个Chalk5等位基因的转录水平在11个组织中均有时间和组织的特异性：在茎、剑叶、4cm和8cm幼穗、抽穗前的颖壳中几乎均不表达,而H94等位基因在根、受精后4天的颖壳、受精后10天的胚乳中特异性表达,且其表达量均高于珍汕97,但在受精后5天的胚乳低于珍汕97。该表达模式与垩白形成的关键时期是一致的。15. Chalk5启动子上两个共有SNPs及其顺式调控原件改变引起的表达量变异很可能是籼稻间腹白率遗传多样性的一个主要原因；SEM及相关基因差异表达分析表明,Chalk5很可能通过影响胚乳储藏物质的形状和空间排列来调控垩白的形成。总之,GS5是通过增加细胞数目来控制种子大小的一个微效正调控因子；GS5三种不同的单倍型把不同品系的粒宽表型分成相应的三组；GS5大粒单倍型是水稻驯化和育种过程中功能获得性的突变型；GS5启动子自然变异是该QTL表型变异的原因,并对水稻种子大小的遗传多样性贡献较大。胚乳特异表达的Chalk5是一个效应很大的正调控籼稻间腹白率的主效QTL基因,并对稻米品质具有大的、普遍性影响；Chalk5启动子自然变异是籼稻腹白率遗传多样性的一个主要原因。紧密连锁的GS5、qSW5和Chalk5基因的克隆为稻米产量与品质的矛盾与统一提供了分子证据。