从受精开始，胚胎的发育始终是细胞内合成活性物质的直接或间接结果。胚胎发育最重要的一个方面就是调节这些特殊的蛋白质和其他大分子物质的合成。寻找到这些特殊的发育信号，对它们进行组织定位，确定它们出现的时间，对深入了解胚胎的发育与组织再生都有着非常重要的意义。 肝脏在胚胎第12周才由前体细胞发育为分化良好的器官，此时它并不具备成熟肝脏的功能。我们认为在胚胎这个发育阶段的肝脏是一种内分泌样器官，其功能很可能是产生特殊的发育信号，调控胚胎细胞的特化和组织发生。本实验收集胚胎样本30例，进行肝组织匀浆的活性分析，在对多个样本进行了多次重复试验后，确定在胎龄小于12周的胚胎肝脏中存在着促肝细胞增殖的活性物质。最终从胎龄小于12周的胚胎肝脏组织提纯出一种新型的肝细胞生长因子，将其命名为人胚胎肝源性因子（human embryo liver-derived factor，hELF），并对其理化性质和生物活性进行鉴定。 <WP=113>一、hELF的提纯与理化性质的鉴定本实验对30个不同胎龄样本的肝组织提取物（SA）进行了生物活性的检测，其中胎龄小于12周的样本14个，胎龄大于12周的样本16个。每个样本的检测均经过3次以上的重复实验。发现胎龄小于12w的胚胎肝组织提取物具有促进肝肿瘤来源的HepG2细胞和SSMC-7721细胞增殖的活性。采用丙酮梯度沉淀（45%～65%）的方法进行初步分离，将活性物质纯化了2倍，回收率达到176.3%。采用超滤浓缩的方法，去除分子量10 000Da以下物质的干扰，确定活性物质的分子量在10 000 Da以上。利用离子交换层析方法进行进一步的纯化，将超滤获得的分子量10 000Da以上的溶液，采用阳离子交换层析柱Mono S，选用50mM pH 4.0的醋酸盐缓冲液，连续纯化2次，洗脱速度1ml/min，收集洗脱液（1ml/管），检测各管洗脱液的促肝细胞增殖活性。结果显示，活性物质被洗脱的盐浓度在25%～35%之间。第一次层析分离，使活性物质被纯化133.5倍，回收率为21.9%，第二次层析，活性物质被纯化11398倍，回收率为9.3%。将纯化后获得的活性物质进行电泳，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图上，在分子量30kD处可见一条清晰的蛋白带，无其它染色带的存在。表明经提纯，我们已经获得了高纯度的hELF。从含有30～50mg蛋白质的胚胎肝组织匀浆中可提纯hELF200～400ng。检测hELF的理化性质，发现它在100℃，15min或60℃，2h的条件下均可维持活性，是一种热稳定的因子。同时，它还耐酸耐碱，1M HCl，4℃条件下放置24h和1M NaOH，4℃条件下放置24h均不能使之失活，它在很宽的pH值范围内都可以维持活性。对尿素不敏感。二、hELF生物活性特征的确定以肝肿瘤细胞株HepG2细胞、SSMC-7721细胞，小鼠乳腺癌细胞系D2F2细胞，人宫颈癌细胞系Hela细胞，成年大鼠肝细胞及人胚胎肝细胞为效<WP=114>应细胞，确定了hELF生物活性的特征。1、hELF促进人肝肿瘤细胞株的增殖hELF对肝肿瘤来源细胞株HepG2细胞、SSMC-7721细胞具有非常强的促增殖作用。在含2%NBCS的培养条件中，HepG2细胞增殖缓慢。但在hELF/2%NBCS培养条件下，HepG2细胞却发生明显而迅速的增殖。即使在不加血清的条件下，在HepG2细胞的培养中加入hELF，细胞仍然可以维持生存，并继续进行增殖。实验组HepG2细胞（2%NBCS/hELF培养液）在加入因子的第2～3天开始明显增殖，此时对照组的细胞几乎没有克隆形成，至第7天结束培养时，实验组的细胞克隆形成率几乎达到了100%，并且克隆体积较大，克隆间发生汇合，而对照组在培养的第7天，只形成了一些小克隆。MTT方法观察细胞增殖状态，显示细胞增殖非常显著。对每一步提纯的物质进行量效关系的检测，可以确定细胞增殖与因子浓度存在明显的量效依赖性，并在一定范围内呈正相关。2、hELF不能促进体外培养的成年大鼠肝细胞的增殖体外培养的成年大鼠肝细胞培养5天，hELF组和对照组增殖差异不明显，OD490数值的差异没有统计学意义。这表明，hELF不能够促进体外培养的成年大鼠肝细胞的增殖。但是hELF在培养的前3天可以增加成年大鼠肝细胞合成尿素氮的水平。3、hELF促进体外培养人胚胎肝细胞的生长hELF对体外培养人胚胎肝细胞的生物活性作用体现在2个方面：1）促进细胞的增殖；2）促进细胞在体外培养中长期维持其肝细胞的典型形态。在培养第5天，可以观察到hELF/10%NBCS组的细胞增殖明显高于10%NBCS对照组。培养12天后，hELF组胚胎肝细胞镜下观察可见大片肝细胞克隆的存在，细胞轮廓清晰，仍维持肝细胞的典型形态，细胞连接紧<WP=115>密，偶可见散在的2～3个细胞在一起发生细胞融合，培养皿内细胞以典型肝细胞形态的细胞为主，肝细胞克隆间可见一些成纤维样细胞增殖。而此时对照组细胞发生融合，形成体积较大的融合体，每个融合体内含有多个细胞核，可达到10个以上，核仁清晰可见，已经很难发现具有肝细胞典型形态特征的细胞，大片的肝细胞克隆消失，取而代之的是成纤维细胞样细胞增殖旺盛，在培养细胞中占较大比例。4、hELF促进小鼠肿瘤乳腺癌细胞株和人宫颈癌细胞株的增殖在Hela细胞和D2F2细胞的培养过程中，hELF组的细胞在培养24～48h，细胞明显增殖，与对照组差异显著。综上所述，可知