恶性黑色素瘤是一种发展迅速,容易广泛转移的高度恶性肿瘤。多发于白色人种,澳大利亚发病率最高,在世界范围内其发病率有逐步增高的趋势。恶性黑色素瘤对常规放疗有较强抗性,对大部分化疗药物天然耐药,免疫治疗、生物治疗成为临床治疗的重要方法,是一种治疗颇为棘手的恶性肿瘤,如何更为高效的治疗将是一项长期、艰巨的事业,需要科研及临床工作者继续共同不遗余力地去努力探寻。机体抗肿瘤效应十分复杂,非特异性和特异性机制交错,细胞免疫与体液免疫互相补充、协调,共同执行免疫监视功能和抗肿瘤效应。体液免疫是指机体免疫系统对肿瘤抗原产生针对肿瘤抗原的特异性抗体,抗体与肿瘤抗原结合后主要通过CDC效应、ADCC作用、调理吞噬等途径来发挥效应。细胞免疫是抗肿瘤免疫的重要机制,参与抗肿瘤免疫的细胞主要有T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。抗肿瘤免疫机制被广泛、成功的应用与肿瘤临床治疗工作。免疫逃逸可涉及肿瘤细胞免疫过程的所有环节如：肿瘤抗原表达、抗原识别、加工、提呈、T细胞增殖、活化和分化以及免疫效应的产生等,使得肿瘤仍可发生和发展,研究肿瘤的免疫逃逸机制对于研究肿瘤发生发展原理、提高机体免疫状态、逆转肿瘤的逃逸、设计新的治疗策略具有极大的促进作用。肿瘤疫苗是通过增强肿瘤特异性抗原的免疫原性,诱发机体产生抗肿瘤免疫应答,以达到逆转肿瘤的逃逸、缩小和消除肿瘤的目的。传统的方法是以肿瘤细胞、肿瘤提取物或某一成分作抗原接种患者,激发免疫反应,达到控制肿瘤的目的。目前研究较多的恶性黑色素瘤疫苗有①神经节苷脂瘤苗神经节苷脂是一组存在于细胞膜上的神经鞘糖脂,将神经节苷脂制成瘤苗与免疫佐剂一起注射,诱导机体产生体液免疫反应,进而介导肿瘤抗原识别并通过ADCC作用或CDC作用杀死肿瘤细胞。②树突状细胞瘤苗体外培养并将各种黑色素瘤相关抗原、肽、肿瘤裂解物等转载到DC中,回输患者体内。DC瘤苗克服了肿瘤细胞瘤苗体内抗原加工和呈递效率低下、多肽或DNA修饰瘤苗注射部位DC细胞数量有限的问题。③DNA疫苗及基因修饰瘤苗DNA疫苗是用编码黑色素瘤抗原的重组DNA质粒、包含各种黑色素瘤抗原基因的重组病毒作为疫苗接种,优点在于抗原全长的DNA序列能提供多个抗原表位,可以免除MHC限制。基因修饰瘤苗是指通过基因工程将细胞因子、共刺激分子等外源性基因转染肿瘤细胞,用于增强其抗肿瘤效应。④多肽瘤苗多肽瘤苗的优势在于具有高度的肿瘤特异性,避免了细胞瘤苗制备过程中的困难,免疫应答易于监控；其不足之处在于,只能靶向作用于少数抗原表位,作用局限于能表达特定MHC单倍型的某一患者群。⑤自体或异体肿瘤细胞疫苗自体肿瘤疫苗能提供多种个体特异的抗原,但获取、纯化肿瘤细胞较难,需要一定量的活体肿瘤标本来制作疫苗。异体肿瘤疫苗从不同患者身上获得的多个肿瘤细胞株,包含了不只一种瘤细胞株以最大化肿瘤抗原的表型。体内预存天然抗体是指未经抗原刺激就在血清中出现的抗体,如抗α-半乳糖苷(α-Gal)的抗体、抗ABO血型抗体及抗Rha抗体。这些预存抗体不需经过抗原识别、加工、提呈、T细胞增殖、活化和分化以及免疫效应的产生这样一系列过程。这些预存抗体大量、丰富,多为IgM,活化补体的能力强大,可引发强烈的超急期免疫排斥反应、输血反应、ABO不相容性器官移植后的超急性移植排斥反应。如果配合新型抗肿瘤疫苗,这些预存抗体会成为我们抗肿瘤的有力武器。有研究者将人体内天然存在的抗α-Gal抗体应用到肿瘤的免疫治疗中。Deriy等通过腺病毒转导a1,3半乳糖基转移酶基因(α1,3-GT)进入肿瘤细胞,使肿瘤细胞表达α半乳糖抗原。用表达该抗原的肿瘤细胞免疫小鼠(α1,3-GTkonckout)后,再接种相同的不表达该抗原的肿瘤细胞,小鼠成瘤率明显降低。另外一种常见的体内天然抗体为抗血型抗体。如果ABO血型不同,体内存在抗血型抗体,将具有相应血型抗原的红细胞输入体内将发生致命性的抗原抗体反应,并激活补体,介导ABO不相容性器官移植后的超急性移植排斥反应。本课题组前期研究中,应用人红细胞膜免疫动物后产生了明确的肿瘤内部炎症反应,并出现了肿瘤坏死,肿瘤细胞凋亡增加,具有明确的抗肿瘤效应,本课题拟在前期研究的基础上,在恶性黑色素瘤细胞表面表达能与血型抗体结合的血型抗原模拟肽,与天然血型抗体发生抗原抗体反应,介导补体及杀伤性细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。大多数良性肿瘤Fas表达与正常组织类似,但恶性肿瘤的Fas表达明显下降或丢失,许多肿瘤细胞通过下调Fas表达实现免疫逃避,因此可通过上调肿瘤细胞Fas表达来增强免疫细胞对肿瘤的杀伤,达到治疗肿瘤的目的。黑色素瘤细胞表面不表达Fas分子,Aragane等用巨细胞病毒作为载体将Fas基因导入黑素瘤细胞中,上调Fas蛋白表达,16h后出现凋亡的形态学变化；体内实验表明,肿瘤细胞Fas的表达明显上调,瘤体重量明显轻于对照组。将Fas反义寡核苷酸转导人高表达Fas的Jurkat细胞,使细胞表面Fas表达下降,可以保护Jurkat细胞免予Fas介导的凋亡。虽然单一治疗方法不可能完全控制肿瘤,但将Fas导入肿瘤细胞以诱导其凋亡,已成为当前研究的热点。巨噬细胞炎症蛋白3β(Mip3β)是Rossi等于1997年通过生物信息学方法发现的一种CC类趋化因子。该基因前体蛋白有98个氨基酸残基的,剪切掉21个氨基酸的信号肽后形成成熟分泌型的Mip 3β,其表达局限于在淋巴结、胸腺及阑尾等淋巴组织。Mip3β具有趋化包括T细胞、B细胞、DC, NK细胞及巨噬细胞等多种细胞。Mip3β还可以通过CCR7的相互作用促进DC细胞与T细胞接触并呈递抗原从而激发有效免疫反应等方面发挥重要作用。活化的单核巨噬细胞分泌Mip-3α/β、MCP-1等多种趋化因子,诱导更多的巨噬细胞活化和募集,产生多种促炎因子以及大量炎症介质,引起局部炎症反应和抑制肿瘤作用。开展本研究的目的和意义体内预存天然抗体不需经过抗原刺激就大量存在血清中,如果配合能与之特异性结合的抗肿瘤疫苗加以充分利用,这些抗体会成为我们抗肿瘤的有力武器。本研究采用噬菌体展示技术筛选能模拟人类血型A抗原表位与抗血型A抗体特异性结合的多肽序列,并与Fas基因的跨膜区及胞内区的融合,在恶性黑色素瘤细胞株B16表达,观察跨膜型血型抗原模拟肽疫苗与血型A抗体特异性结合的能力,以及介导产生CDC效应、ADCC效应和凋亡的能力,我们还观察了Mip3β对抗肿瘤免疫反应的增强作用。本课题属原始创新性研究,力求为临床提供新型恶性黑色素瘤疫苗,提高恶性黑色素瘤生物治疗的效率,同时也为新型抗肿瘤疫苗在其他肿瘤治疗打下基础,提供经验。第一章血型A抗原模拟多肽的筛选目的筛选抗血型A抗体特异性噬菌体模拟表位,为血型抗原模拟肽疫苗的研究探索新途径。方法应用噬菌体表面展示技术,以抗血型A抗原的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程。随机挑取30个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定阳性克隆,最后对阳性克隆进行DNA序列分析,以确定血型A抗原的模拟表位。结果经噬菌体富集后,从随机筛选的30个克隆中得到12个阳性克隆,经测序及翻译后确定血型A抗原的模拟表位的氨基酸序列为Tyr-Val-Asp-Ser-Lys-Ala-Phe-Arg-Ala-Val-Val-Arg。结论用噬菌体随机12肽库成功筛选得到血型A抗原的模拟表位,为开展用血型A抗原模拟表位防治恶性黑色素瘤研究创造了条件。第二章跨膜型血型A抗原模拟多肽一Fas融合基因的设计及生物信息学分析目的设计跨膜型血型A抗原模拟多肽-Fas融合基因,预测其编码蛋白的结构和特性,以指导进一步抗恶性黑色瘤素效应的实验研究。方法从Fas基因全长mRNA中识别其信号肽、胞外段、跨膜区及胞内段,以血型A抗原模拟多肽取代FAS基因的胞外段部分,设计血型A抗原模拟多肽-Fas融合基因。利用BLAST软件进行融合基因的基因及编码蛋白的序列比对,利用蛋白分析专家系统(ExPASY)中基因和蛋白序列、结构信息分析工具预测融合基因编码的蛋白质的理化特性,利用软件SignalP、TMPRED、secpred_sopma SWISS-MODEL预测融合蛋白的信号肽、跨膜区域、二级结构及三维空间构象。结果所设计的融合基因全长588bp,其编码蛋白的相对分子量和等电点理论预测值分别是22.048 KDa和9.36,其编码的蛋白由1个信号肽区、1个跨膜区、47.18%的α螺旋、12.82%的延伸链、3.08%的β转角和36.92%的无规卷曲组成。结论所设计的血型A抗原模拟多肽-Fas融合基因经生物信息学软件预测,具有与Fas基因的相似理化特性、二级结构及空间构象,可以通过信号肽引导血型A抗原模拟肽表达于细胞膜表面。第三章pIRES-P/Fas重组质粒的构建及体外抗恶性黑色素瘤细胞效应目的建立表达跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗的恶性黑色素瘤细胞株B16,并检测体外细胞毒活性。方法化学的方法合成跨膜型血型A抗原模拟多肽-Fas融合基因,通过酶切、连接构建入双表达质粒的多克隆位点A,酶切、测序鉴定,用脂质体LipofectamineTM 2000导入恶性黑色素瘤细胞B16(pIRES-P/Fas组),以转染空质粒的B16细胞为对照(pIRES组)。收集转染后48小时的B16细胞,RT-PCR及Western blot法检测模拟肽/Fas融合基因的mRNA及蛋白表达,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测重组质粒介导的补体依赖性细胞毒效应(CDC)、抗体依赖的细胞介导细胞毒效应(ADCC)及凋亡效应。结果经酶切及测序鉴定质粒构建成功,RT-PCR在预期位置检测到特异性条带,Western blot印迹表明,表达产物具有特异的结合抗血型A抗体活性。不同分组不同血清稀释度的跨膜型血型A抗原模拟多肽重组质粒介导的CDC效应经析因设计的方差分析显示差异有统计学意义(F=7895,P<0.001),多重比较结果提示适宜的血清稀释度为1：32。不同分组不同抗体浓度跨膜型血型A抗原模拟多肽重组质粒介导的ADCC效应经析因设计的方差分析结果显示不同分组主效应差异有统计学意义(F=677.817,P<0.001),多重比较结果提示适宜的抗体浓度为20μg/ml。不同分组不同抗体浓度跨膜型血型A抗原模拟多肽重组质粒介导的凋亡效应经析因设计的方差分析结果显示不同分组差异有统计学意义(F=358.075,P<0.001),多重比较结果提示适宜的抗体浓度为5μg/ml。结论跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗成功构建,并且可在B16细胞膜稳定表达,且可通过介导CDC效应、ADCC效应及凋亡发挥对黑色素瘤细胞B16的杀伤作用。第四章pIRES-P/Fas-Mip 3β重组质粒的构建及体外抗恶性黑色素瘤细胞效应目的建立双表达跨膜型血型A抗原模拟肽和巨噬细胞炎症蛋白3β(Mip3β)的恶性黑色素瘤细胞株B16,并检测体外细胞毒活性。方法以人扁桃体为模板PCR扩增Mip3β,通过酶切、连接构建入双表达质粒的多克隆位点B,酶切、测序鉴定,用脂质体LipofectamineTM 2000导入恶性黑色素瘤B16细胞。收集转染后48小时的B16细胞,RT-PCR检测其mRNA表达,CCK-8法检测CDC效应、ADCC效应及凋亡效应。实验分组：pIRES-P/Fas-Mip3β组、pIRES-P/Fas组、pIRES-Mip 3β组、pIRES组。结果RT-PCR在预期位置检测到特异性条带；单因素方差分析提示不同分组之间CDC效应总体差异有显著性(F=1079,P<0.001),ADCC效应总体差异也有显著性(F=97.597,P<0.001),凋亡效应总体差异也有显著性(F=146.943,P<0.001)。多重比较发现pIRES-P/Fas-Mip 3β组和pIRES-P/Fas组之间ADCC(P=0.164)差异有显著性,但CDC (P=0.168)及凋亡效应(P=1.000)之间的差异无统计学意义。结论重组质粒在细胞中表达的趋化因子Mip3β未能增强模拟肽重组质粒介导的抗恶性黑色素瘤细胞效应,考虑在体外实验的环境中Mip3β基因并未能有效地发挥其对T细胞、单核细胞、树突状细胞及嗜中性粒细胞等多种免疫细胞的趋化作用有关。