戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV),是一种经肠道传播,严重危害人类健康的病毒性肝炎病原体。然而,其致病机制和复制机理还不是很清楚。病毒编码的miRNA(VmiRNA)可以通过调控自身蛋白的表达逃逸宿主的免疫应答,从而促进病毒复制和持续性感染。信号调节蛋白α(SIRP-αα)是HEV编码的miR-A6的靶蛋白,其在天然免疫调节中发挥着重要作用,SIRP-α可能在病毒逃逸宿主天然免疫反应中发挥重要作用。本研究的主要工作是探究HEV编码的miRNA-A6调控SIRP-α促进病毒复制的机制,主要包括3个部分:1、miR-A6 对 SIRP-α 的调控SIRP-α是HEV编码的miR-A6的靶蛋白,为了探究HEV是否对SIRP-α的表达具有调控作用,我们将HEV(灭活HEV作为对照)接种A549细胞。结果显示,HEV可以诱导细胞内SIRP-α的表达。分析miR-A6是否对SIRP-αα的表达具有调控作用,我们将miR-A6真核表达载体转染细胞。结果发现,miR-A6可以有效地诱导靶蛋白SIRP-α的表达。进一步分析miR-A6是否特异性调控SIRP-α的表达,我们构建了 miR-A6的突变体真核表达载体(突变种子序列),分别转染细胞。结果显示,miR-A6特异性调控SIRP-α的表达,种子序列突变后,降低了其对SIRP-α的诱导功能。我们研究了 miR-A6和SIRP-α对HEV复制的影响。结果发现,miR-A6能够有效促进HEV复制,过表达SIRP-α同样可以促进HEV的复制,干扰SIRP-α的表达,HEV的复制受到影响。2、HEV与SIRP-α的相互作用病毒与宿主的相互作用是研究病毒致病机制的一大热点。为了探究HEV哪一个开放阅读框与SIRP-α具有相互作用,我们对HEV的不同开放阅读框进行了转染实验。结果显示,HEV编码的ORF3蛋白诱导SIRP-α的表达。ORF3蛋白具有四个结构域:D1、D2、P1和P2,为了分析ORF3哪一个结构域对SIRP-α具有诱导作用,我们构建了 ORF3蛋白的结构域缺失突变体真核表达载体,分别转染细胞。结果显示,ORF3蛋白的Dl结构域在诱导SIRP-α表达过程中发挥十分重要的作用。进一步通过免疫共沉淀实验证实,ORF3蛋白与SIRP-α具有相互作用。3、miRNA-A6通过调控SIRP-α抑制IFN-β表达天然免疫是细胞抵抗病原体入侵的第一道防线,宿主通过识别病毒的复制中间体dsRNA,激活IRF3的磷酸化,合成大量I型干扰素,从而消灭入侵的病原体。然而,HEV是否可以逃逸宿主的天然免疫应答还不清楚。所以,我们通过dsRNA类似物刺激细胞,产生大量IFN-β,然后接种HEV(灭活HEV作为对照),分析HEV对IFN-β是否具有抑制作用。结果显示,HEV可以有效的抑制细胞内IRF3的磷酸化,抑制IFN-β的表达。为了探究HEV是否是通过编码的miR-A6抑制细胞内IFN-β的表达,我们将miR-A6转染dsRNA类似物刺激后的细胞。结果显示,miR-A6能够有效的抑制细胞内IRF3的磷酸化,抑制IFN-β的表达。进一步分析miR-A6是否通过特异性调控SIRP-α抑制IFN-β的表达,我们将细胞敲除SIRP-α后转染miR-A6真核表达载体。结果发现,敲除SIRP-α表达后,miR-A6对IRF3的磷酸化和IFN-β的表达的抑制能力明显降低。此外,ORF3蛋白可以诱导SIRP-α的表达,并且可以与其相互作用。为了探究ORF3是否对细胞内IFN-β的表达具有抑制作用,我们将ORF3真核表达载体转染细胞。结果显示,ORF3蛋白可以与SIRP-α相互作用,有效抑制细胞内IRF3的磷酸化,抑制IFN-ββ的表达。进一步研究发现,ORF3蛋白的D1结构域在抑制细胞内IFN-β的表达过程中起到关键作用。本论文发现,HEV自身编码的miRNA-A6在病毒感染过程中,能够有效诱导宿主细胞内SIRP-α的表达,抑制宿主细胞内IRF3的磷酸化,抑制I型干扰素的合成,有效促进HEV的复制。