现代药理作用研究表明,中药知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、降血压、抗炎、抗衰老、降低转氨酶等多种活性,主要活性成分为知母皂苷(Timosaponin,TS)。其中知母皂苷BⅡ(Timosaponin BⅡ,TSBⅡ)是知母皂苷中含量最大且专属性成分,2010年《药典》把TSBⅡ的含量作为知母药材的质量控制指标之一。TSBⅡ可以显著改善多种拟痴呆动物模型的学习记忆功能,其作用机理为上调胆碱能N&M受体,改善脑缺血及缺血损伤。目前TSBⅡ正在按照中药、天然药物注册分类Ⅰ进行研究开发,对于早老性痴呆、血管性痴呆及脑卒中的预防和治疗,具有较好的新药开发前景。　　 本研究的目的是通过制备TSBⅡ的单克隆抗体,建立测定TSBⅡ含量的ELISA方法,并利用该单克隆抗体探索分离纯化TSBⅡ的亲和层析技术。　　 主要的实验结果如下:　　 (1)以高碘酸钠法成功合成了免疫抗原,平均每个载体分子上连接9个TSBⅡ分子,可以免疫小鼠;3次加强免疫后选择效价为32000的小鼠作为免疫脾细胞的供体,使用PEG法促进骨髓瘤细胞SP2/0与免疫细胞的融合,经过克隆化和筛选,获得了一株最佳的能稳定分泌特异性抗体的细胞株EG9D2H5H6;经接种小鼠、腹水诱导法产生大量抗体,用Protein G亲和层析柱分离纯化腹水,冻干后的单克隆抗体平均产量为7.44mg/ml,单抗的分子量约为150kD。　　 (2)利用单抗建立测定TSBⅡ含量的ELISA方法,回归方程为y=1.1192-0.2222×ln(x),相关系数为R=0.9946,直线范围为100 ng/ml-3.125ng/ml,灵敏度为27.03 ng/ml,4.34 ng/ml为其最低检测限,与结构类似物的交叉反应率很低,精密度、准确度均较好。该方法与传统的方HPLC-ELSD和HPLC质谱联方法相比,具有灵敏度高、特异性强、前处理简单、易操作、反应速度快、检测费用低、适于现场监控和大批量样本分析等优点,可以为中药知母的质量控制提供一种检测技术。　　 (3)利用单抗制备了一个0.71ml的亲和层析柱,以夹心ELISA检测抗体偶联率为97.41％,即每毫升胶偶联11.64mg抗体;该柱绝对柱容量为86.498μg;选择0.1 mol/L Tris-HCL0.5 mol/LNaCL(PH9.7)+40％甲醇(v/v)作为洗脱液,流速为0.5ml/min,实验5次的平均回收率为99.01％,至少能在30天之内使用十次以上。该法操作简单,且能很好的分离纯化TSBⅡ,这对于研究TSBⅡ的药用价值及知母的市场开发具有重要意义。