定向进化改造酶的结构,是提高酶催化活性和改变选择性(化学选择性、区域选择性和立体选择性)的重要手段,近年来受到广泛关注。来源于不动杆菌NCIMB 9871的环己酮单加氧酶(AcCHMO)是Baeyer-Villiger单加氧酶中研究最为广泛的一种,对于其天然反应具有较高的反应活性和立体选择性。随着研究的深入,AcCHMO被应用于更多底物的氧化反应,甚至能够催化杂原子化合物氧化。手性有机硼酸酯是一个重要的有机反应中间体,可以作为构建手性碳-碳键的前体。本论文通过定向进化手段,对AcCHMO氧化拆分消旋硼酸酯反应的立体选择性进行调控,并将该反应同化学偶联反应进行串联,获得手性产物1-苯乙基取代的苯衍生物。同时调控AcCHMO对不同环大小和取代环酮的活性及立体选择性。主要研究成果总结如下:本论文首先选择AcCHMO底物结合口袋周围的L143、F246、F432、L435等位点,以丙氨酸A、苯丙氨酸F、亮氨酸L三种侧链大小不同的氨基酸作为代表氨基酸进行定点突变构建高度聚焦的小型突变库,以α-苯乙基硼酸频哪醇酯作为底物,筛选出具有高立体选择性的突变株。分析了重要突变株中氨基酸残基对氧化α-苯乙基硼酸频哪醇酯反应的立体选择性的影响,在最优单位点突变的基础上进行迭代,最终获得了两个具有立体选择性互补的AcCHMO突变株,L143F/F432I/L435A和F246A/L435F/L507A。两个突变株催化氧化拆分反应可以分别得到ee值在75%以上的(R)-和(S)-α-苯乙基硼酸频哪醇酯,以及相反构型的(S)和(R)-α-苯乙醇产物(ee值分别为58%和68%)。论文在得到手性α-苯乙基硼酸频哪醇酯的基础上,将其与取代的碘苯亲电试剂偶联,成功构建了一个酶促化学串联一锅体系,得到手性的1-苯乙基取代的苯衍生物。在分别对Suzuki偶联反应和AcCHMO全细胞体系催化的串联反应进行条件优化后,最终可以以40%的产率和75%的ee值得到手性产物1-苯乙基取代的苯衍生物。此外,论文扩展了工程化AcCHMO催化环酮的底物谱,探讨了从环丁酮到环辛酮等一系列底物的反应结果,对比分析了底物环大小与酶空腔空间结构的关系,筛选出了分别能够提高各环酮底物催化活性的突变株。另外,还在环酮上增加了苯基取代基,对比3-苯基环丁酮、3-苯基环戊酮和4-苯基环己酮的反应结果,发现432位点和435位点对含苯环取代基的环酮底物有明显的立体选择性调控作用。F432L突变株能够分别催化3-苯基环丁酮与4-苯基环己酮氧化得到与WT构型相反的对映异构体,经过进一步突变优化两种底物都实现了大于99%ee值的选择性。对于3-苯基环戊酮,同样以F432L和L435G为调控突变株,实现更加复杂的区域选择性与立体选择性同时调控,得到与WT完全不同的结果。