羧酸酯酶(Carboxylesterase, CarE)是一个多功能超家族成员,它广泛存在于各种生物中,包括昆虫、植物、哺乳动物和微生物等。羧酸酯酶具有广泛的功能,它能有效催化含羧基酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性多种化合物的水解。它在外源物的解毒,信息素的降解,神经发生和发育调节等方面起着重要的作用。为进一步探究羧酸酯酶基因的多种功能,本研究采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)方法,对家蚕(Bombyx mori)中三种组织特异性表达的羧酸酯酶基因的转录水平进行了定量研究,结果如下:1.头部特异性表达的BmCarE基因的表达定量分析采用qRT-PCR方法,对家蚕头部特异性高表达的羧酸酯酶基因BmCarE-6、BmCarE-12、BmCarE-15和BmCarE-16在正常饲养的5龄3天家蚕头部、触角、下颚须等组织,以及在4μg/mL辛硫磷诱导后在家蚕头部中的转录水平进行检测,并采用家蚕Actin3管家基因对检测结果进行归一化处理。结果表明:头部特异性高表达的羧酸酯酶基因都主要集中在触角和下颚须中表达,且在辛硫磷诱导后,表达水平逐渐降低。由于触角和下颚须是家蚕幼虫的主要嗅觉器官,对气味或信息素分子的识别、结合和降解都主要发生在这一器官,而羧酸酯酶具有水解酶的活性,所以我们推测这4个羧酸酯酶基因可能主要参与气味或信息素的降解功能。2.中肠特异性表达的BmCarE基因转录水平的测定采用qRT-PCR方法,对家蚕中肠特异性高表达的羧酸酯酶基因BmCarE-8、BmCarE-11、BmCarE-13和BmCarE-14在4μg/mL辛硫磷诱导后的家蚕中肠中的转录水平进行检测。
　　结果表明:BmCarE-8、BmCarE-13和BmCarE-14的转录水平都是在辛硫磷诱导后24h出现高峰,分别为对照组的217倍、129倍和61倍,之后逐渐下降到正常水平;而BmCarE-11的转录水平变化较小,是在诱导后48h出现高峰,为对照组的5.8倍,之后逐渐下降到正常水平。由于家蚕的中肠是抵御外源物经口服致病的第一个屏障,而在辛硫磷诱导后,这4个羧酸酯酶基因在中肠中的表达水平随着中毒症状在家蚕身上出现到消失的变化过程而变化。即在家蚕中毒不久后,羧酸酯酶基因表达升高,随后家蚕中毒症状消失,羧酸酯酶的表达水平又降低,所以我们推测这4个羧酸酯酶基因可能与杀虫剂的抗药性相关。3.家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9的鉴定及其与BmCarE-7的定量研究利用5′/3′RACE和RT-PCR方法克隆了一个家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9,GenBank登录号为EU523534。利用qRT-PCR方法研究发现BmCarE-9在5龄第3天家蚕丝腺组织特异性表达,BmCarE-9和另一丝腺特异性高表达基因BmCarE-7均在5龄期随着丝腺的生长发育表达量逐渐增高,到末期表达水平逐渐降低。此外,BmCarE-9和BmCarE-7在辛硫磷诱导后的丝腺组织中的转录水平在24 h达到最高,分别为对照组的4.5倍和3.3倍,然后逐渐下降;而在辛硫磷诱导的脂肪体组织中,BmCarE-9和BmCarE-7表达量均在48 h达到最高,分别为对照组的4172倍和856倍,然后又突然下降。推测这2个基因可能与丝腺的生长发育或丝蛋白的合成相关,也可能参与了对外源物的解毒作用。目前,昆虫中关于羧酸酯酶的研究主要集中于其在杀虫剂中的作用,而对于家蚕羧酸酯酶参与信息素或气味降解以及生理调节方面的研究还比较少,本研究在前人的基础上,对3种家蚕组织特异性表达的羧酸酯酶基因的转录水平进行了定量研究,发现头部特异性表达的BmCarEs主要在家蚕幼虫的触角和下颚须中高表达;中肠特异性表达的BmCarEs在辛硫磷诱导的中肠组织中表达水平先上升后下降;丝腺特异性表达的BmCarEs主要在中部或后部丝腺中高表达,且表达量在5龄期随着丝腺的生长发育而变化。而在辛硫磷诱导的对照组中,表达水平先升高后降低。BmCarEs在不同组织中的表达水平变化为进一步研究和利用家蚕这一经济昆虫提供帮助,为深入研究昆虫羧酸酯酶基因的功能打下基础。