水稻中独脚金内酯的结构鉴定及检测方法的研究

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独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一种新近研究发现的抑制植物分枝的新型植物激素。水稻是世界上最重要的粮食作物,为世界上一半以上的人口提供主要食物,因此水稻产量直接影响各国的粮食安全,而分蘖是决定水稻产量的重要因素之一。因此对水稻中已知或未知的SLs进行结构鉴定,探究环境营养状况(如磷胁迫)对SLs合成和分泌,以及水稻分蘖的影响,以期在农业生产上为通过SLs来调控水稻合理株型,提高水稻产量的应用提供理论依据。本实验以粳型常规稻日本晴、SLs合成缺乏型突变体d10和SLs不敏感型突变体d14为材料,通过高分辨质谱对水稻中内源SLs进行结构鉴定,建立了一种液相色谱-串联质谱法对水稻中SLs的检测方法,并利用此方法对水稻中独脚金内酯在磷胁迫应用上的规律进行验证。结果如下:1、在水稻根和根分泌物中鉴定出了一种SLs,5-脱氧独角金醇。首先通过TSQ Quantum液质联用仪对水稻中SLs及其衍生物进行初步筛选,得出10个能产生SLs共同结构D环对应的特征离子m/z=97的分析物m/z=266,282,294,298,315,317,331,347,352,405。因此初步认为这10个分析物可能是SLs。然后通过LTQ-Orbitrap高分辨质谱对这10个分析物进行结构鉴定。先对水稻根和根分泌物进行全扫描及相关分析,结果得出这10个离子中只有m/z=331分析物为独脚金内酯或其衍生物此分析物,并鉴定出了分析物的分子结构。再对水稻根和根分泌物样品进行m/z=331的子离子扫描,根据子离子m/z=97结构信息对全扫描得到的m/z=331分析物的结构进行进一步确证,也进一步证明此化合物为独脚金内酯。根据文献资料,我们在水稻根和根分泌物中鉴定出的独脚金内酯为5-脱氧独脚金醇。2、建立了水稻中SLs的HPLC-MS/MS检测方法。优化并确定了最佳的质谱和色谱检测条件,实验最终确定在正离子模式下对分析物进行监测,采用水溶液-乙腈进行二元梯度洗脱。同时还研究了水稻根、茎和根分泌物中SLs的前处理方法,研究表明,乙腈水溶液对水稻根、茎样品中SLs的提取效果最好,再经过Florisil固相萃取柱净化可以有效消除基质效应;水稻根分泌物中的SLs通过Plexa固相萃取柱-Florisil固相萃取柱连续净化法可以减小基质效应,获得较好的峰形和较高的回收率。对建立的此检测方法进行评价,分析物GR24在0.5~1000μg/L浓度范围内,线性良好,相关系数为0.9972;在根、茎样品2μg/kg、4μg/kg和8μg/kg添标水平,及根分泌物样品0.01μg/L、0.02μg/L和0.04μg/L添标标水平下,平均回收率在80%-102%之间,RSD%小于7.2%;水稻根、茎和根分泌物中GR24的方法检出限(S/N≥3)分别为为20pg/g、50pg/g和0.5ng/L。在以GR24为研究对象建立的检测方法的基础上,筛选鉴定出5-脱氧独脚金醇的另一个子离子,将它和特征离子分别作为定性离子和定量离子,建立了水稻中SLs的液相色谱串联质谱的检测方法。3、对水稻中SLs的功能和SLs在磷胁迫应用上的规律进行了验证。通过对三个品种进行外施1μmol/L GR24的处理实验,充分证明了SLs有抑制水稻分蘖的功能,同时SLs信号传递对SLs功能的发挥是必须。本研究磷胁迫试验下测得的水稻根和根分泌中5-脱氧独脚金醇的含量及水稻分蘖数目的变化规律和Mikihisa Umehara等文献报道的,对应实验材料对应指标的变化规律完全符合,所以也就是验证了Mikihisa Umehara等的结论由缺磷(磷胁迫)引起的独脚金内酯水平的提高有助于抑制水稻分蘖芽的生长。
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