黑色素沉积主要包括黑色素的产生和转运两个过程,受多个基因调控。SOX6是黑色素细胞内新发现的转录因子,但其作用机制尚未报道。本文对SOX6在羊驼黑色素细胞中的表达以及功能进行了研究。试验方法和结果如下:1.对SOX6基因进行克隆和序列分析发现,该蛋白的保守功能域包括SOX-T细胞因子。MTSVTFGTPERRKGS序列基序中的氨基酸T119位可能被CDK5磷酸化。羊驼SOX6蛋白磷酸化位点的序列与人、狗、马、羊、大鼠的序列有90%相似度,而在预测的磷酸化位点,羊驼序列与相应的牛序列具有的相似度最高。2.CDK5是调控黑色素生成的一种蛋白激酶,可调控黑色素细胞黑色素的生成。本试验在羊驼黑色素细胞中过表达和沉默SOX6,通过细胞免疫组化、免疫共沉淀、实时荧光定量PCR、免疫印迹等方法验证SOX6在黑色素形成中的功能。结果显示SOX6在羊驼黑色素细胞细胞质中表达;SOX6与CDK5、β-catenin和Cyclin D1相互作用;SOX6过表达上调Cyclin D1、CDK5、MITF、TYR、TYRP1、DCT m RNA表达和蛋白质水平表达,降低β-catenin m RNA表达和蛋白质水平表达,沉默组反之;SOX6过表达使羊驼黑色素细胞黑色素增多,SOX6对羊驼黑色素细胞生成黑色素起调控作用。本试验将为进一步探讨SOX6在黑色素形成中的作用及其影响黑色素生成的机制奠定基础。3.为了进一步揭示SOX6是否对黑色素的转运起调控作用,本试验通过免疫共沉淀结合CHIP-seq方法挖掘SOX6启动转录的靶基因。结果显示:SOX6直接靶向调控的基因很多,其中包括黑色素转运的重要调控基因MLPH以及黑色素生成路径中重要的基因MAP3K4、MYO5b、MLPH、TMEM63A和SLC6A1等。实时荧光定量PCR结果显示:SOX6使MAP3K4、MYO5b、MLPH、TMEM63A和SLC6A1基因m RNA表达水平升高。4.为了筛选SOX6直接启动MLPH转录的最强启动区,本试验使用双荧光素酶报告基因筛选与SOX6直接结合的靶基因MLPH的最强启动区,并进行功能验证。结果显示,将MLPH promoter区域分成四段,其中第二片段（F2）活性最强;实时荧光定量PCR与免疫印迹结果显示:MLPH、MYO5a和Rab27a表达量呈上升趋势。FontanaMasson特殊染色结果显示:转录因子SOX6使黑色素生成增多;透射电镜切片结果显示:SOX6组黑色素细胞中内质网明显增多,出现不同阶段的黑色素小体,羊驼黑色素细胞细胞质中的微丝微管也明显增多。5.为了揭示SOX6在调控黑色素细胞生物学过程中所影响的下游分子路径及生物过程,本试验通过生物信息学分析预测到的与MLPH互作的lnc RNA即FBXO22-ASI构建过表达载体,并转入羊驼黑色素细胞,随后进行转录组测序。结果显示:FBXO22-ASI涉及调控多个分子通路,其中包括细胞自噬、MAPK通路、Wnt信号通路等。实时荧光定量PCR分析ATG5、MAPK3、STMN1、TSPAN12和MITF的m RNA表达水平,其结果与RNA测序结果相一致。结论:转录因子SOX6在黑色素细胞中分别通过被CDK5磷酸化和靶向MLPH调控黑色素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1和TYRP2以及转运基因MYO5a和Rab27a的表达进而影响黑色素生成和黑色素颗粒的转运,从而调控羊驼黑色素沉积过程。同时参与黑色素细胞中的自噬等通路,也可能在其他生物学功能中发挥重要功能,这为后续进一步研究SOX6功能提供理论依据。