【摘 要】
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背景:乳腺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居恶性肿瘤首位,严重危害人类健康。导致乳腺癌患者不良预后的原因主要包括:治疗后的复发与转移,产生耐药,缺乏有效的早期诊断标志物。因此,乳腺癌的防治研究形势迫切。深入研究乳腺癌发生发展及耐药的分子机制,在临床应用上为乳腺癌的分子诊断和靶向治疗寻找新的靶点,对乳腺癌的临床研究具有重要意义。自噬是一种高度保留的溶酶体介导的分解代谢及细胞内转运途径,广泛存
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背景:乳腺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居恶性肿瘤首位,严重危害人类健康。导致乳腺癌患者不良预后的原因主要包括:治疗后的复发与转移,产生耐药,缺乏有效的早期诊断标志物。因此,乳腺癌的防治研究形势迫切。深入研究乳腺癌发生发展及耐药的分子机制,在临床应用上为乳腺癌的分子诊断和靶向治疗寻找新的靶点,对乳腺癌的临床研究具有重要意义。自噬是一种高度保留的溶酶体介导的分解代谢及细胞内转运途径,广泛存在于所有真核细胞中,是真核细胞调节新陈代谢和内环境稳态的重要过程。自噬活性的失调与多种疾病密切相关,如:神经退行性疾病、脂肪肝、传染性疾病、II型糖尿病、心血管疾病、肿瘤等,因此,自噬也是很多疾病潜在的治疗靶点。近年研究表明,自噬活性的异常与乳腺癌的发生发展及耐药密切相关,但其中具体的作用机制尚不明确。液泡型ATP酶（V-ATPase）是溶酶体膜上重要的质子泵,参与溶酶体酸化和自噬调控,该酶的组装及活性的异常与乳腺癌的发生发展密切相关,但该酶的各亚基在乳腺癌中的作用机制仍不清楚。前期我们通过对V-ATPase各亚基在各亚型乳腺癌中的表达和生存相关性进行筛选,发现ATP6AP1在Luminal型乳腺癌组织中异常高表达,且与患者的生存期呈负相关。ATP6AP1是V-ATPase的辅助亚基,调控V-ATPase的组装与活性,并参与细胞内p H调节和膜运输等重要过程。于是我们推测,ATP6AP1能促进Luminal型乳腺癌的进展,并通过细胞实验证实。但ATP6AP1是否通过调控V-ATPase和自噬促进乳腺癌的生长及耐药仍不清楚,因此,深入研究ATP6AP1在乳腺癌中的作用及分子机制,可以揭示ATP6AP1在肿瘤中新的功能及机制,为乳腺癌的治疗提供新的靶点及策略。研究目的:1.验证ATP6AP1在乳腺癌组织中的表达及临床病理研究;2.研究ATP6AP1异常高表达在Luminal型乳腺癌发生发展及应激耐受中的作用;3.验证ATP6AP1促进自噬的激活;4.探究ATP6AP1通过激活自噬促进Luminal型乳腺癌进展及耐药;5.阐明ATP6AP1激活自噬的分子机制。研究方法:1.基于TCGA数据库中乳腺癌相关数据,对V-ATPase各亚基在各亚型乳腺癌中的表达和生存期相关性进行筛选分析。然后,利用免疫组化检测乳腺癌临床组织样本中ATP6AP1在癌组织与癌旁组织中的表达水平;2.构建三个ATP6AP1的干扰质粒,建立稳定表达ATP6AP1的Luminal型乳腺癌细胞系。通过细胞生长曲线、Transwell等实验,在细胞水平上检测ATP6AP1对乳腺癌的增殖和迁移能力的影响;3.在细胞水平通过过表达/干扰ATP6AP1,利用Western blot检测LC3B II/I和SQSTM1/p62蛋白水平的变化,以及利用细胞免疫荧光检测自噬水平的变化;4.利用干扰/过表达ATP6AP1的稳定细胞系,通过MTT实验检测细胞对TAM半抑制浓度（IC50）的变化;流式细胞术检测TAM处理后细胞凋亡水平的变化,同时用氯喹加以验证,从而检测ATP6AP1对Luminal型乳腺癌耐药的影响;5.利用RFP-GFP-LC3B双荧光系统,检测细胞内自噬流的变化;利用溶酶体酸性探针检测溶酶体酸化水平,同时用氯喹加以验证。利用CO-IP实验验证ATP6AP1与Rab7/VPS39蛋白的相互作用,探究ATP6AP1激活自噬的分子机制。研究结果:1.ATP6AP1在Luminal型乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织,且ATP6AP1的表达水平与Luminal型乳腺癌患者的生存期呈负相关;2.ATP6AP1异常高表达会促进乳腺癌的增殖、迁移及应激耐受;3.ATP6AP1高表达能增强自噬活性;4.ATP6AP1通过激活自噬促进Luminal型乳腺癌进展及耐药,而抑制自噬可以阻断ATP6AP1对乳腺癌细胞增殖及迁移的促进作用;5.ATP6AP1通过促进V-ATPase介导的溶酶体酸化,增强Rab7/HOPS复合物介导的自噬体/溶酶体融合,进而激活自噬。研究结论:1.ATP6AP1在Luminal型乳腺癌中高表达,并通过激活自噬促进Luminal型乳腺癌进展及耐药;2.ATP6AP1通过调控V-ATPase和Rab7/HOPS复合物,促进溶酶体酸化和自噬体/溶酶体融合,进而激活自噬。
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