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原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界范围内流行率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一，与世界其他国家相比，我国HCC死亡率居各国之首，但是肝癌的治疗一直是一个棘手的问题。目前肝癌治疗的主要手段是手术切除，但手术切除只适用于部分早期患者，而且手术后的高复发率影响最终的疗效。由此可见，对HCC发病机制和治疗手段的研究是当务之急。 Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的一个新成员，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而不见于终末分化的成熟组织。研究发现，Survivin对细胞凋亡和细胞分裂周期有双重调控作用：Survivin直接作用于caspase，主要抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或干扰caspase-9的活性，阻断各种刺激诱导的下游细胞凋亡的共同通路；Survivin特异性地在细胞周期G2／M期表达，通过与细胞有丝分裂纺垂体的微管结合，参与对细胞基因的转录调控；Survivin可以直接抑制caspase-3活性以降低肿瘤细胞对许多化疗药物的敏感性。由于Survivin选择性的组织细胞分布特征以及抑制细胞凋亡特殊的作用机理，可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。 研究证明，HCC的发生发展涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活过程，有针对性地选择在HCC发生发展过程中发挥重要作 第四军医大学博士学位论文.亩亩..亩....口目西面.百面面面面面.面画口口.画.面面面面面面面面面面面面面面面百.面面面百面面面面口肠亩.亩百.口...口...亩百日亩亩亩百百亩亩亩百亩亩草用的癌基因或抑癌基因，利用反义寡核昔酸技术、基因剔除、基因替代以及基因转导等技术，抑制或敲除癌基因的表达，以期达到基因治疗HCC的目的。 肿瘤凋亡抑制基因靶向治疗的优点是可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而对正常组织几乎没有不良影响。RNA干涉(RNAint。rference，RNAi)能够特异、有效地降解mRNA，引起转录后水平的基因沉默，在小鼠和人的体外培养细胞中成功阻断了基因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。利用RNAi技术能否在体内、体外成功敲除人肝癌细胞中Survivin基因的表达，诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖是本实验的主要内容。 研究目的:探讨Survivin基因在人肝癌细胞增殖和细胞凋亡中的作用机制，为人肝癌的基因治疗提供理论依据。 实验方法: 1、应用SABC免疫组织化学染色、RT一pCR和western b10t等技术对87例HCC及其50例癌旁肝组织石蜡标本、8例HCC组织和4种人肝癌细胞系(HepGZ、SMMC一7721、HHCC、HCC一9724)中Survivin、P53、Bel一2蛋白和Survivin mRNA以及细胞凋亡进行检测。 2、通过脂质体介导将Survivin基因转染人肝癌细胞系HopGZ中，建立稳定表达survivin基因的HepGZ细胞模型(S竹一HepGZ);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、流式细胞分析(FCM)以及生长曲线等检测转染前后HepGZ中Survivin蛋白及其mRNA的表达、细胞周期和细胞生长的变化。 3、通过脂质体介导将Survivin基因的dsRNAi真核表达载体转染人肝癌细胞系SMMC一7721，建立dsRNAi的SMMC一7721细胞模型(S一RNAi一7721);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、Westernblot、FCM分析、TUNEL技术、透射电镜、DNA Ladder分析以及生长曲线等检测转染前后S翩C一7721中Survivin蛋白及其mRNA的表达、细胞周期和细胞凋亡、细胞增殖以及细胞生长的变化。 4、以BALB/c裸鼠为研究对象，采用皮下注射H即G2、Svv一HepGZ和S枷C一7721、S一刚Ai一7721细胞悬液，建立肝癌细胞 第四军医大学博士学位论文币亩亩.口.亩百百.亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩面面面面面面面面.口国面面面面面面亩百口百目面.面面面面口.面面面面面百西面亩亩.亩.面......口亩亩百亩亩..百亩亩亩亩.百.亩口的裸鼠动物模型;通过测量和称重等方法观察肿瘤形成和肿瘤的生长状况;采用SABC免疫组织化学染色和RT一PCR检测肿瘤组织Survivin蛋白及其mRNA的表达。 5、应用Western blot、 TUNEL技术、DNA Ladder分析和FCM分析等检测抗肿瘤药物表阿霉素在相同浓度(10 pg/ml)不同时间作用于HepGZ、SVV一HepGZ和SMMC一7721、S一RNAi一7721细胞后，Sury ivin蛋白及其mRNA的表达以及细胞周期和细胞凋亡的变化。 实验结果: 1 .Survivin基因在HCC组织和人类肝癌细胞系表达上调，其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、有否转移、Bd一2的表达、组织分化程度及临床分期等均无相关关系，而与突变型P53的表达密切相关。 2.转染Survivin基因的HepGZ细胞出现了Survivin蛋白及其mRNA的表达，成功建立了稳定表达Survivin基因的HepGZ细胞模型，该细胞模型表现出明显的增殖活性。 3.转染Survivin基因dsRNAi的S枷C一7721细胞，Survivin蛋白及其mRNA表达消失，成功建立了稳定表达S盯vivin基因dsRNAi的SMMC一7721细胞模型，该细胞模型表现为Survivin基因在蛋白水平和转录水平表达受阻，出现细胞凋亡的典型特征，细胞生长明显受抑。 4.转