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第一部分
黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-表达的影响
目的:观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。
方法:取原代培养8d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、黄芪注射液溶剂对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖,各组于复氧复糖后0h、0.5h、2h、6h、24h、48h、72h和120h采用免疫组织化学染色法和蛋白免疫印迹(western blotting)法检测海马神经元Caspase-3蛋白的表达,并采用原位杂交和RT-PCR方法检测海马神经元Caspase-3 mRNA的表达。
结果:免疫组织化学结果显示:正常对照组大鼠海马神经元核规整,细胞突起明显,有少许细胞胞浆黄染。缺氧缺糖/复氧复糖组大鼠海马神经元核皱缩、突起回缩,大量细胞胞浆黄染,胞核内有黄色颗粒,阴性对照组未见胞浆和突起黄染的阳性神经元。黄芪注射液溶剂对照组海马神经元亦可见到明显的核皱缩、突起回缩和胞浆黄染,海马Caspase-3阳性神经元形态学的变化与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致。黄芪注射液组大鼠海马神经元有轻微核皱缩,可见部分神经元胞浆黄染。随着复氧复糖时间的延长,缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组及黄芪注射液组均可见到阳性神经元胞核中黄色颗粒逐渐增多,于24h达到高峰。与正常对照组相比,除0h和0.5h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组在2h、6h、24h、48h、72h和120h各时间点海马Caspase-3阳性神经元数目、占神经元总数的百分率及平均光密度值均明显增多(P<0.05),于24h达到高峰。黄芪注射液溶剂对照组以上各个指标的变化趋势均与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致(P>0.05)。除0h和0.5h之外,黄芪注射液组各时间点阳性神经元数目、占神经元总数的百分率及平均光密度值均比缺氧缺糖/复氧复糖组显著减少(P<0.05)。原位杂交检测结果显示:Caspase-3 mRNA阳性神经元形态、数目、占神经元总数的百分率及平均光密度值的变化趋势与Caspase-3蛋白的变化趋势完全一致。Western blotting结果显示:除0h和0.5h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元Caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),复氧复糖24h平均灰度值最高；与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点Caspase-3蛋白的平均灰度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组除0h和0.5h外,在各个时间点Caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果显示:除0h和0.5h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元Caspase-3 mRNA的平均光密度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),24h平均光密度值最高；与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点Caspase-3 mRNA的平均光密度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在除0h和0.5h外的各个时间点Caspase-3 mRNA的平均光密度值均明显降低(P<0.05)。
小结:黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因Caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。
第二部分
JNK抑制剂对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3表达的影响
目的:观察JNK抑制剂(SP600125)对凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。
方法:取原代培养8d的大鼠海马神经元,随机分为7组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组、黄芪注射液组、DMSO组(二甲基亚砜组即SP600125溶剂组)、SP600125组、SP600125+黄芪注射液组。除正常对照组外,其余各组进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖,并于复氧复糖后6h、24h、72h采用蛋白免疫印迹和RT-PCR方法检测海马神经元Caspase-3的表达。
结果:Western blotting结果显示:缺氧缺糖/复氧复糖组在6h、24h、72h海马神经元Caspase-3蛋白平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组、DMSO组各时间点Caspase-3蛋白平均灰度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组、SP600125组、SP600125+黄芪注射液组在各个时间点Caspase-3蛋白平均灰度值均明显降低(P<0.05),但此三组之间无明显差别(P>0.05)。RT-PCR结果显示:缺氧缺糖/复氧复糖组在6h、24h、72h海马神经元Caspase-3mRNA平均光密度值均较正常对照组明显增加(P<0.05)；与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组、DMSO组各时间点Caspase-3mRNA平均光密度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组、SP600125组、SP600125+黄芪注射液组在各个时间点Caspase-3mRNA平均光密度值均明显降低(P<0.05),但此三组之间无明显差别(P<0.05)。
小结:黄芪注射液可通过抑制JNK3信号通路的激活而减少Caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。
第三部分
黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的作用机制
目的:探讨黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖致大鼠海马神经元钙调蛋白(CaM)的表达、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响。
方法:取原代培养8d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖,各组于复氧复糖后0h、0.5h、2h、6h、24h、48h、72h和120h采用蛋白免疫印迹和RT-PCR法检测海马神经元钙调蛋白(CaM)及CaM mRNA的表达,并用黄嘌呤氧化酶法测定各组海马神经细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性,用TBA比色法检测丙二醛(MDA)的含量。
结果:western blotting结果显示:复氧复糖后0h、0.5h、2h、6h、24h、48h、72h和120h各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元CaM蛋白表达条带平均灰度值均较正常对照组明显升高(P<0.05)；与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点CaM蛋白的平均灰度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时间点CaM蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果显示:各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元CaM mRNA的平均光密度值均较正常对照组明显降低(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点CaMmRNA的平均光密度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时间点CaM mRNA的平均光密度值明显升高(P<0.05)。SOD活性和MDA含量检测结果显示:各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元SOD活性均较正常对照组明显降低(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05)；与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点SOD的活性、MDA含量无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时间点SOD的活性明显升高(P<0.05),MDA含量明显降低(P<0.05)。
小结:黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元自由基的生成与释放,抑制钙超载,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。
结论:
1黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因Caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。
2黄芪注射液可通过抑制JNK3信号通路的激活而减少Caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。
3黄芪注射液能够升高海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖后SOD活力、降低MDA含量,抑制自由基的生成与释放,发挥脑保护作用。
4黄芪注射液可增加CaM的生成,抑制钙超载,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。