论文部分内容阅读
研究背景与目的病毒性肺炎是由多种呼吸道病毒引起的临床常见病、多发病,流感病毒为其最常见的病原体。流感病毒性肺炎作为流感病毒感染引起的严重并发症,具有较高的死亡率。目前认为流感病毒性肺炎的主要发病机制是病毒入侵后与机体相互作用导致的过度炎症反应和免疫病理损伤,这也是新冠肺炎、SARS等临床重症病毒性肺炎的共有发病机制。现今临床对于流感病毒性肺炎的治疗,尚缺乏专属的特效治疗药物。中医药具有多靶点、多机制及多环节的作用特点,在抗炎及免疫调节方面疗效显著,对防治病毒性肺炎具显著优势。小檗碱(Berberine,BBR)是从黄连、黄柏等清热解毒药物中提取的异喹啉生物碱,是目前公认的具有广泛抗炎和免疫调节作用的药物。课题组前期研究表明,小檗碱可显著减轻流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎性损伤,降低病毒性肺炎小鼠的死亡率,还可明显降低流感病毒感染的巨噬细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的水平,但其具体作用机制尚不明确。近年来,细胞自噬限制炎性体活化,抑制炎症反应的研究引起广泛关注。且相关研究表明细胞自噬参与肺部炎性反应,NLRP3炎性体过度活化在甲型流感病毒性肺炎的炎性反应中也发挥重要作用。细胞内的累积的ROS主要来源于损伤线粒体,且被认为是NLRP3炎性体激活调控的中心,而线粒体自噬是清除损伤线粒体,防止ROS累积的主要方式。因此,本研究从线粒体自噬-ROS-NLRP3炎性体这一新的角度,探究小檗碱是否可通过诱导线粒体自噬,清除流感病毒感染的组织或细胞内累积的ROS,进而使NLRP3炎性体激活受限,遏制流感病毒引起的炎性损伤,以进一步探讨小檗碱抑制流感病毒诱发过度炎症反应的机制,为小檗碱治疗流感病毒性肺炎的机制研究提供新的理论和实验依据,同时为抑制流感病毒性肺炎过度炎症反应的发生寻找新途径。研究方法1.细胞实验:构建流感病毒PR8感染小鼠J774A.1巨噬细胞模型(1)设置正常组、模型组(PR8,MOI=1)、MSU(150μg/mL)组、BBR(16.8μM)组、PR8+BBR 组、PR8+MSU 组及 PR8+MSU+BBR 组。Western blot 检测 NLRP3 蛋白表达,流式细胞术检测Caspase1活性,ELISA检测IL-1β分泌水平。(2)设置BBR组及Mito-TEMPO(线粒体特异性抗氧化剂,500μM)组,流式细胞术检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、线粒体 ROS(mitochondrial ROS,mtROS)水平及Caspase1活性,同时检测NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平。(3)设置正常组、模型组、PR8+BBR 组、PR8+3-MA(5 mM)组及 PR8+3-MA+BBR组,同时设置BBR对照组与3-MA对照组。Western blot检测LC3Ⅱ、P62蛋白表达;免疫荧光检测自噬体-线粒体共定位;透射电镜观察细胞自噬结构。(4)实验分组同(3),流式细胞术检测MMP、mtROS释放水平及Caspase1活性;同时检测NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平。(5)设置正常组、模型组、PR8+BBR组、PR8+CsA(5mM)组及 PR8+CsA+BBR 组,同时设置BBR对照组与CsA对照组。Western blot检测各组细胞LC3Ⅱ、BNIP3蛋白表达,免疫荧光检测自噬体-线粒体-BNIP3共定位;同时J774A.1巨噬细胞转染BNIP3siRNA,检测LC3Ⅱ、BNIP3 蛋白表达。2.动物实验构建小鼠流感病毒性肺炎模型,分为正常组、模型组、BBR(10mg/kg/d)治疗组、BBR+3-MA(15mg/kg/d)治疗组。观察各组小鼠肺大体病变、肺指数,Western blot检测小鼠肺组织LC3Ⅱ、P62及BNIP3蛋白表达,流式细胞术检测各组小鼠肺组织ROS释放水平,Western blot检测Caspase1p20、NLRP3蛋白表达,流式细胞术检测MMP、mtROS释放水平及Caspase1活性;同时检测NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平。研究结果1.流感病毒感染可显著提高巨噬细胞内NLRP3蛋白表达、Caspase1活性及IL-1β分泌水平,导致NLRP3炎性体活化;小檗碱可降低流感病毒感染的巨噬细胞NLRP3蛋白表达、Caspase1活性及IL-1β分泌水平,抑制NLRP3炎性体活化。2.流感病毒可导致巨噬细胞线粒体损伤,mtROS累积及NLRP3炎性体活化;小檗碱和Mito-TEMPO均可减轻流感病毒导致的线粒体损伤,减少mtROS释放,抑制NLRP3炎性体激活。表明mtROS在NLRP3炎性体活化中的重要作用,而小檗碱抑制NLRP3炎性体活化可能与其减轻线粒体损伤,从而减少细胞内mtROS累积有关。3.小檗碱可提高流感病毒感染的巨噬细胞内自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,减少p62蛋白表达;同时免疫荧光实验可见明显自噬体-线粒体共定位,透射电镜可观察到线粒体自噬小体结构。表明小檗碱可诱导流感病毒感染的巨噬细胞线粒体自噬。4.自噬/线粒体自噬抑制剂3-MA可加重流感病毒感染的巨噬细胞线粒体损伤,增加mtROS累积,促进NLRP3炎性体活化;小檗碱可3-MA加剧的线粒体损伤,减少mtROS释放,逆转其导致的NLRP3炎性体活化。表明小檗碱减少mtROS释放,进而抑制NLRP3炎性体活化的机制与其诱导线粒体自噬有关。5.小檗碱可提高流感病毒、CsA及BNIP3siRNA干预的巨噬细胞内BNIP3、LC3II蛋白表达,降低p62蛋白表达,并可见明显的自噬体-线粒体-BNIP3共定位;在BNIP3-siRNA转染组LC3II蛋白表达均有所下降,表明敲减BNIP3可在一定程度抑制小檗碱对细胞线粒体自噬的上调作用。表明小檗碱诱导线粒体自噬部分依赖BNIP3途径,并可能与其提高BNIP3蛋白表达有关。6.小檗碱可显著减轻流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎症损伤,提高LC3Ⅱ、BNIP3蛋白表达,减少p62蛋白表达;同时小檗碱可减少小鼠肺组织ROS释放,降低Caspase1p20、NLRP3蛋白表达及IL-1β分泌水平,而自噬抑制剂可逆转小檗碱的作用。体内实验验证了体外实验的研究结果,表明小檗碱减轻流感病毒性肺炎小鼠肺部炎性损伤的机制与其诱导线粒体自噬,减少ROS释放,进而抑制NLRP3炎性体过度活化有关。研究结论小檗碱可诱导线粒体自噬,清除损伤的线粒体,减少ROS释放,进而抑制NLRP3炎性体过度活化,减少IL-1β等炎性因子分泌,从而抑制流感病毒引起的过度炎症反应,减轻流感病毒感染导致的炎性损伤。小檗碱诱导线粒体自噬部分依赖BNIP3途径。本研究为抑制流感病毒性肺炎过度炎症反应的发生提供了新途径,为小檗碱治疗流感病毒性炎的机制研究提供了新的理论和实验基础。