【摘 要】
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Tospovirus病毒在全球范围内广泛分布且危害严重。Tospovirus病毒成员番茄斑萎病毒(Tomato sponed wilt virus,TSWV)及风仙花坏死斑病毒(Impatiens necroticspot virus,INSV)
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Tospovirus病毒在全球范围内广泛分布且危害严重。Tospovirus病毒成员番茄斑萎病毒(Tomato sponed wilt virus,TSWV)及风仙花坏死斑病毒(Impatiens necroticspot virus,INSV)编码的NSs已证实是病毒的沉默抑制子,通过结合dsRNA和siRNA而抑制宿主的RNA沉默作用。番茄环纹斑点病毒(Tomatozonate spot virus,TZSV)是在云南发现的Tospovirus新种,在番茄和辣椒上引起叶部环斑、顶芽坏死及果实黄化或坏死环斑。为探明TZSV的NSs基因功能,本研究克隆了TZSV、TSWV、INSV的NSs基因并构建到植物表达载体pGD上,分别与pGD-smGFP共侵润转GFP基因的16c本生烟,长波紫外灯(主波长365nm)照射下显示TZSV的NSs基因与TSWV、INSV的NSs基因功能相似,能够抑制16c本生烟的局部沉默及系统沉默。用Western blotting及Northern blotting检测侵润区GFP蛋白及GFPmRNA的表达量,结果显示在侵润3-6天后,与阴性对照相比,TZSV、TSWV、INSV的GFP蛋白及GFP mRNA的表达量增加,证明TZSV编码的NSs为病毒的沉默抑制子。基于生物信息学对Tospovirus病毒NSs保守位点及NSs结构的分析,构建了14个TZSV NSs基因缺失突变体,农杆菌共侵润野生型本生烟,发现NSs N端氨基酸的缺失对蛋白活性影响要比C端缺失影响大,推测TZSV NSs蛋白质序列的61-330区域是抑制RNA沉默的关键区域。
利用原核表达技术获得TZSV的NSs蛋白,并免疫家兔获得了NSs的多抗血清,为下一步研究该蛋白在细胞内定位与其功能的关系,作用方式等研究提供便利条件。
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