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目的:柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3, CVB3)是导致人类急、慢性心肌病的重要病原一。其预防和治疗性疫苗的研究极为迫切。VP1是CVB3主要的衣壳蛋白,含有多个T、B细胞表位,可诱导机体产生免疫应答。国内外研究表明,编码VP1的DNA疫苗,能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并对感染小鼠具有一定的保护能力,但不能有效阻止致死量病毒感染。研究证明,一些细胞因子作为基因佐剂,可大大提高DNA疫苗的免疫效应。本室构建了MDC ( macrophage-derived chemokine, MDC )与CVB3VP1融合基因质粒,保护率有一定的提高,但不能达到实用程度。推测可能是融合蛋白中某一成分或两种成分发生空间结构的不利变化,影响与APCs结合和/或VP1蛋白的免疫原性。如何保证融合蛋白的稳定性和生物学活性是本研究探讨的问题。接头序列(Linker)的介入是基因融合技术之一,即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来,使之在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链,其中起连接作用的氨基酸称为Linker。Linker的选择对构建有功能活性的融合蛋白是至关重要的。它的存在有利于蛋白质两侧功能区的正确折叠,以允许形成各自独立的构象。长度和组成是选择Linker时主要应考虑的问题。研究表明,亲水性强和柔性好的Linker是构建融合蛋白的首选。故甘氨酸(glycine, Gly, G)和丝氨酸(serine, Ser, S)是构建Linker的常用氨基酸。G是所有氨基酸中分子量最小,没有手性碳,所以柔性最好,S是亲水性最强的氨基酸,能增加亲水性。Linker的长度过长,在融合蛋白的生产过程中对蛋白酶比较敏感,导致活性融合蛋白的产量减低,应用较短的Linker,可以克服重组蛋白酶分解的问题,但可能使两个分子距离太近导致蛋白功能的丧失。据资料显示10-22个氨基酸效果较好。故本研究引入长度为10、15、19个由G和S组成的Linker来构建表达MDC与CVB3VP1融合蛋白核酸疫苗。方法:(1)用PCR方法分别扩增出带Linker的MDC-L15(用于构建Linker长度为15个氨基酸的融合蛋白)、MDC-L19(用于构建Linker长度为19个氨基酸的融合蛋白)、L15-VP1(用于构建Linker长度为15个氨基酸的融合蛋白)和L19-VP1(用于构建Linker长度为19个氨基酸的融合蛋白)片段;(2)将4种基因的扩增产物与pGEM-T载体连接,转化DH5α大肠杆菌,接种含Amp的2YT培养基,提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选重组子;(3)经酶切鉴定和测序确认后,用合适的核酸内切酶从这4种克隆载体切取目的基因片段。将目的基因片段MDC-L15和L15-VP1与经合适限制性内切酶酶切的pcDNA3载体连接,构建真核表达重组质粒pcDNA3/MDC-L15-VP1。同样的方法构建pcDNA3/ MDC-L19-VP1。(4)用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/MDC-L19-VP1、pcDNA3/MDC- L15- VP1、pcDNA3/MDC-L10-VP1、pcDNA3/VP1和pcDNA3,用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化;(5)动物实验:将6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组,每组14只;5组分别为pcDNA3组、pcDNA3/VP1组、pcDNA3/MDC-L10-VP1组、pcDNA3/MDC-L15-VP1组和pcDNA3/MDC-L19-VP1组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后,股四头肌注射免疫小鼠,每次每只接种100μg,每4周免疫1次,共免疫3次;于2、6、10周,眼眶静脉取血,分离血清,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中和抗体。第3次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏用于检测细胞免疫水平,每组8只小鼠用5 LD50的CVB3腹腔内攻击,观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天。每组剩余的3只小鼠用3 LD50CVB3攻击,注射病毒后第7天取血,分离血清进行病毒滴度测定。处死后,取心脏,制备石蜡切片,HE染色,观察各组小鼠心肌病理学改变。结果:(1) PCR扩增出MDC-L15、MDC-L19、L15-VP1和L19-VP1基因片段,基因片段的长度与预期值相符。(2)成功构建了原核克隆载体pGEM-T/MDC-L15,pGEM-T /MDC-L19, pGEM-T/L15-VP1和pGEM-T/L19 -VP1, DNA测序证实目的基因序列与Genbank登录序列相同。(3)基因片段插入pcDNA3后酶切结果证实成功构建了pcDNA3/MDC-L15-VP1和pcDNA3/MDC-L-19-VP1。(4)不同免疫次数,各组血清中和抗体的平均效价分别为:pcDNA3/VP1组1:7.07,1:10.59,1:25.20;pcDNA3/MDC- L10-VP1组1:7.93,1:22.45,1:31.74; pcDNA3/MDC-L15-V P1组1:8.91,1:23.78,1:39.99;pcDNA3/MDC-L9-VP1组1:10.00,1:25.20,1:50.39;pcDNA3组各次平均效价均低于1:5。pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-L10-VP1、pcDNA3/MDC-L15-VP1和pcDNA3/MDC-L19-VP1组中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,经单因素方差分析差别有统计学意义(P<0.01);第三次免疫后,除pcDNA3/VP1组和pcDNA3/MDC-L10-VP1组无显著性差异,其余各组两两比较均有显著性差异(P <0.01)。(5)特异性淋巴细胞增殖实验和CTL杀伤实验结果表明,随Linker长度的增加增殖能力和杀伤活性显著增强,pcDNA3/MDC-L19-VP1组和其它各组相比差别均有统计学意义(P<0.01)。(6)用5LD50攻击小鼠,各组21天生存率分别为:pcDNA3/MDC-L-15-VP1组和pcDNA3/MDC-L19-VP1组均为37.5%,pcDNA3/MDC-L10- VP1组25.0%,pcDNA3/VP1组12.5%, pcDNA3组11天内全部死亡。(7)随Linker长度的增加血中病毒滴度依次降低, pcDNA3/MDC-L19-VP1组小鼠和其它各组相比差别均有统计学意义。(8)心肌病理学检查随Linker长度的增加心肌病理改变依次减轻,但并无明显异。结论:(1)用PCR方法成功扩增MDC-L15、MDC-L19、L15-VP1和L19-VP1基因片段。(2)成功构建真核表达质粒pcDNA3/MDC-L15-VP1、pcDNA3/MDC-L19-VP1。(3)用5LD50的CVB3攻击后,小鼠的生存率随着Linker长度的加长有一定的提高。(4)小鼠血清中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高,第三次免疫后pcDNA3/MDC-L19-VP1组中和抗体滴度最高,与其它各组相比差异均有统计学意义。(5)特异性淋巴细胞增殖实验和CTL杀伤实验结果表明pcDNA3/MDC-L19-VP1组增殖指数和杀伤率最高,与其它各组相比差异均有统计学意义。(6)中和抗体滴度、细胞免疫检测、血中病毒滴度、和心肌切片病理学分析结果一致,说明融合基因疫苗pcDNA3/MDC-L19-VP1是较理想的一种疫苗。