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中国水仙(Narcissus tazetta var.chineneis)属石蒜科植物,为中国传统十大名花之一,是福建省省花及漳州市市花。但近年来因其品种和花色单一等原因,产业发展陷入瓶颈。黄酮类化合物主要参与植物花色形成,其代谢途径中一系列结构基因的表达受R2R3-MYB等转录因子的调控。本课题以中国水仙’金盏银台’为材料,从中国水仙鳞茎盘转录组数据库中筛选出两条R2R3-MYB转录因子,分别命名为NtMYB5和NtMYB6,使用RT-PCR和RACE技术克隆出这两条基因的全长序列,进行序列分析;通过实时荧光定量PCR技术检测其在中国水仙不同成花时期以及不同组织部位的相对表达水平;构建表达载体并转化农杆菌,进行烟草瞬时表达和烟草稳定转化实验研究基因功能,并分析烟草瞬时表达叶片和转基因植株中类黄酮代谢途径相关结构基因的表达。研究结果将了解水仙类黄酮代谢途径的R2R3-MYB转录因子的功能,为进一步了解类黄酮代谢途径的调控网络提供依据。本研究主要结果如下:1.利用RT-PCR技术从中国水仙花瓣中克隆得到NtMYB5基因编码区序列,序列分析表明该基因开放阅读框全长为681bp,编码226个氨基酸。blast结果显示NtMMYB5与茶树CsMYB4a、柿子DkMYB13、大豆GmMYB5等相似度较高;蛋白多重序列比对分析发现NtMYB5含有R2和R3结构域和一个pdLNLD/ELxiG/s的氨基酸抑制基序;系统进化树分析结果NtMYB5与花青素合成抑制因子聚为一类;通过对NtMYB5在中国水仙不同花期花瓣和副冠以及不同器官的表达,发现NtMYA5表达量在花器官中较高,且随花开放表达量逐渐上升。2.利用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙鳞茎盘中克隆得到NtMYB6基因cDNA序列,序列分析显示获得的序列共1008bp,其中包含完整大小为750bp的开放阅读框,共编码249个氨基酸;blast结果显示NtMYB6与野草莓FvMYB12。通过蛋白多重序列比对分析显示该基因含有R2和R3结构域。进化树结果分析显示该基因同原花青素促进因子亲缘关系较近;NtMYB6基因在在鳞茎盘中的表达量最高。3.构建pSAK277-NtMYB5和pSAK277-NtMYB6基因植物表达载体。首先进行烟草叶片瞬时表达实验,分别将StMYB、NtMYB5+StMYB、NtMYB6、NtMYB6+StbHLH等组合注射烟草叶片,结果显示NtMYB5显著抑制花青素合成促进因子StMYB的效果并下调烟草类黄酮代谢途径中大部分结构基因表达;单独注射NtMYB6基因仅上调烟草PAL和4CL基因表达.4.在稳定转化烟草中,NtMYB5和NtMMY6的表达使得转基因植株花瓣颜色变浅,NtMYB5的效果更加明显。与对照相比,NtMYB5转基因植株花瓣中类黄酮代谢途径大部分结构基因的表达受到抑制,但是黄酮醇分支FLS的表达上调;NtMYB6转基因烟草花瓣中原花青素分支的LAR基因的表达上调。5.以上结果表明,NtMYB5是花青素合成的抑制因子,在中国水仙花中抑制花青素的合成;NtMYB6是原花青素合成的激活因子,可能通过调控关键基因LAR的表达在中国水仙鳞茎盘中促进原花青素的合成。