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猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病。该病对两周龄以内新生仔猪危害尤为严重,可导致感染仔猪发生严重的呕吐、腹泻与脱水,死亡率可达100%。该病现已遍及世界各主要养猪国家与地区,给养猪业带来了严重的经济损失。本研究以TGEV S基因及N基因为靶基因,以猪白细胞介素6(pIL-6)和猪粒细胞-巨噬细胞因子(pGM-CSF)基因为基因佐剂,进行了TGEV DNA疫苗的构建与免疫原性的研究,主要研究内容如下:1.TGEV S基因与N基因的克隆及真核表达质粒的构建采用RT-PCR扩增TGEV SC-H株S基因5′端(覆盖A、B、C、D四个抗原位点)和N基因,分别将其插入pMD19-T载体,构建重组质粒19T-S与19T-N。对19T-S和19-N的核苷酸序列测定与分析表明:克隆的TGEV SC-H株S基因长度为2127 bp,可编码708个氨基酸残基;克隆的N基因长度为1149 bp,可编码382个氨基酸残基。序列比对分析显示:TGEV SC-H株S基因编码的氨基酸序列与其它TGEV毒株的同源性在95.5%～99.7%之间,N基因编码的氨基酸序列与其它TGEV毒株的同源性在98.2%～100%之间。研究以pVAX1为载体,构建了单独表达TGEV S基因、N基因的真核表达质粒pVAX-S、pVAX-N以及融合表达TGEV S基因、N基因的真核表达质粒pVAX-S-N。以脂质体转染法将构建的三种真核表达质粒分别转染COS-7细胞,并以间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达。结果显示,转染的COS-7细胞呈现特异性荧光,表明上述构建的3种重组质粒可在体外正确表达。TGEV S基因与N基因真核表达质粒pVAX-S、pVAX-N与pVAX-S-N的成功构建为TGEV DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。2.猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及猪白细胞介素6基因的克隆与表达研究采用RT-PCR方法从经刀豆蛋白A(ConA)刺激的猪外周血淋巴细胞中分别扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)及猪白细胞介素6(pIL-6)基因并将其克隆至pMD-19T载体,构建重组质粒19T-GM与19T-IL6。核苷酸序列测定与分析表明:扩增的pGM-CSF基因ORF长度为435 bp,可编码144个氨基酸残基,扩增的pIL-6基因ORF长度为639 bp,可编码212个氨基酸残基。本研究一方面以pET-32a(+)为载体,分别对pGM-CSF与pIL-6的成熟蛋白编码区进行了原核表达,并制备了相应pGM-CSF与pIL-6重组蛋白的多克隆抗血清;另一方面以pVAX1为载体,分别构建了表达pGM-CSF与pIL-6的真核表达质粒pVAX-GM与pVAX-IL-6,体外将上述两种质粒转染COS-7细胞后,通过Western-blot检测到pGM-CSF与pIL-6在细胞中的表达。pVAX-GM与pVAX-IL-6的成功构建将其作为DNA疫苗佐剂的应用奠定了基础。3.TGEV DNA疫苗免疫原性的研究分别将TGEV DNA疫苗pVAX-S、pVAX-S-N、pVAX-S+pVAX-N、pVAX-S+pVAX-IL6与pVAX-S+pVAX-GM通过腿部肌肉注射6周龄NIH小鼠,间隔两周加强免疫一次,共免疫3次。分别在首疫后的14、35与42d通过间接ELISA测定免疫小鼠血清特异性TGEV IgG抗体水平。结果表明:各免疫组均可有效诱导特异性TGEV血清IgG抗体的产生,显示了TGEV DNA疫苗良好的免疫原性。pVAX-S+pVAX-N质粒混合免疫组抗体水平高于pVAX-S单基因质粒免疫组以及双基因融合表达质粒pVAX-S-N免疫组,在免疫后的35d与42d存在极显著性差异(P＜0.01)。同时,pVAX-S免疫组抗体水平在整个免疫过程中高于pVAX-S-N免疫组,在免疫后42天差异极显著(P＜0.01)。pVAX-IL6与pVAX-GM作为基因佐剂对TGEV抗体的产生均有促进作用,pVAX-S+pVAX-IL6免疫组TGEV抗体水平高于pVAX-S+pVAX-GM组,二者在免疫后的35d、42d均存在显著性差异(P＜0.05)。在首疫后的42d采集免疫小鼠外周血,采用流式细胞仪进行CD3+、CD4+与CD3+、CDS+T淋巴细胞亚群数量检测,结果显示,pVAX-S肌肉注射小鼠后可有效激发免疫小鼠的细胞免疫应答。pVAX-N、pVAX-IL6、pVAX-GM对细胞免疫应答均有不同程度的加强作用,pVAX-N对细胞免疫应答的促进作用优于pVAX-IL6,而后者优于pVAX-GM。4.减毒沙门氏菌携带TGEV S基因DNA疫苗口服免疫的研究研究将真核表达质粒pVAX-S电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建了携带TGEV S基因DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S)。将SL7207(pVAX-S)体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,通过间接免疫荧光证实pVAX-S被有效传递入细胞进行了目的蛋白的表达。小鼠灌胃接种SL7207(pVAX-S)后,提取小鼠回肠末端肠道细胞总RNA为模板,通过RT-PCR检测到S基因的转录。将重组菌以5×10~8、1×10~9与2×10~9CFU/只的剂量灌胃接种小鼠,表明SL7207(pVAX-S)具有相对良好的安全性。将重组菌分别以1×10~7CFU、1×10~8CFU与1×10~9 CFU/只的剂量灌胃接种小鼠,检测小鼠免疫后特异性TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体水平。结果表明,重组菌可有效激发免疫小鼠特异性TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体的产生,具有良好的免疫原性。通过比较三个不同剂量免疫组间的抗体水平进一步表明,免疫剂量直接影响到激发的特异性抗体应答强度:1×10~7 CFU免疫剂量只能激发微弱的特异性血清IgG与肠道IgA抗体,整个免疫过程中1×10~9 CFU免疫剂量组的特异性TGEV血清IgG与肠道IgA抗体在三个免疫组中最高,且在免疫后第六周显著高于(P＜0.05)1×10~8 CFU免疫组。研究为TGEV口服DNA疫苗的研究和应用奠定了基础。