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肝脏有很多重要的功能，包括解毒和很多生理功能。肝功不全将导致一些如氨、酚、硫醇等水溶性毒素，以及芳香氨基酸、游离脂肪酸、胆酸、非结合型胆红素、内生性苯二氮(艹卓)及一些假性神经递质等需与蛋白结合的非水溶性毒素的蓄积。上述毒素均被在肝功不全病人的血清中检测到过，并被认为是肝性脑病、脑水肿、肺水肿、肾功和心功不全的病因(Awad SS，etal．，2000)。在药物代谢方面，肝硬化病人的安定(Diazepam，DZP)半衰期比正常人长约5倍。另外，安定和其他苯二氮(艹卓)类药物常被用于有躁动的肝性脑病的病人(Andreasen PB，et al．，1976)。 肝脏可清除多种毒素。有人认为内生性苯二氮(艹卓)在肝性脑病的发病机制中发挥了很重要的作用(Itzhak Y，et al．，1995)。 近年来人们寄予人工生物肝脏很大希望，使之成为治疗肝功不全晚期一种有效手段。目前有很多种人工生物肝脏设备被应用于基础和亚临床研究。本实验采用了一种3维立体的容器来培养肝细胞作为人工生物肝脏设备。该设备有很多优点，如培养细胞密度高，长期应用可靠性良好，可在细胞和培养液之间更有效地交换营养、废物和气体(Matsumura，1993)。Enosawa等人曾以该设备培养肝细胞株，并降低了急性缺血性肝功不全猪的血浆氨浓度。他们应用的是转染的HepG2细胞(HepG2-GS)，该细胞可过表达谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)。谷氨酰胺合成酶是一种氨代谢旁路中的酶，它主要分布于肝小叶中央静脉的周围，它对氨的亲和力比氨基甲酰-磷酸合成酶要高(Enosawa S，et al．，2000)。HepG2-GS的功能主要限于代谢氨；而很多毒素和药物如睾丸酮、利多卡因、红霉素和苯二氮(艹卓)类则是由细胞色素P450 3A4(cytochrome P450 3A4，CYP3A4)代谢的。 目的 本实验拟建立一种转染GS和CYP3A4基因，过表达此两种酶的HepG2-GS-3A4细胞系，体外测定其氨和苯二氮(艹卓)类代表性药物——安定的代谢率；并将其应用于上述人工生物肝脏设备，体外测定其氨和苯二氮(艹卓)类代表性药物安定的代谢率;最后，建立急性肝功不全加安定中毒犬模型，并以上述人工生物肝脏系统治疗以辅助代谢血清安定和氨。 因此，本实验目的为: 1.建立HePGZ一Gs一3A4细胞系，体外测定其安定与氨的代谢率。 2.人工生物肝脏循环器中培养HePGZ一GS一3A4细胞，并体外测定其安定与氨的代谢率。 3.建立急性肝功不全加安定中毒犬模型，并以上述人工生物肝脏系统治疗以辅助代谢血清安定和氨。、方法、结果 首先，在建立HePGZ一GS一3A4细胞系之后，在培养皿中测定其体外安定和氨的代谢率。安定和它的代谢产物以HPLC法检测。结果发现0 .1一30林岁血DZP在4小时内被HePGZ一GS一3A4细胞呈时间一浓度依赖性代谢。DZP代谢率约为0.12土0.006一3.213土0.210林扩mF丫mg Pro-tein。HePGZ一GS一3A4对DZP的N一去甲基化和3一经基化Km为204.34，61 .55卜M;HepGZ一GS一3A4对DZp的N一去甲基化和3一经基化Vm分别为106.90，85.13PmoF而可mg Protein。 0.1、lmM氨被HePGZ一GS一3A4细胞代谢6小时后，代谢量分别为34.3%和43.1%。HePGZ一GS一3A4细胞对0.lmM和lmM氨的代谢率分别为1 8 .6，234.0林酬h/mg protein。 然后，将约4.0 x 108的HePGZ一GS一3A4细胞接种于Enosawas等应用的同样的人工生物肝脏循环器中(EnosawaS，etal·，2000;US patent5270207【1993」)。在循环器的反应器中，肝细胞附着于一种缠绕于中轴的玻璃纤维膜上。该反应器外腔内有温水循环，使其内腔保持37OC。培养液、02和C02可从反应器上面不断地输人。24小时后，新鲜的培养液以luday的速度输人反应器，在反应器内充分混合后，以同样速度排出。接种细胞后约7天，通过检测反应器内培养液内葡萄糖和乳酸含量，了解到反应器内细胞近汇合时，开始测定DZP和氨的代谢率。停止培养液循环。然后将含DzP和NH4CI的培养液充人反应器，使其终浓度达到DzPS林扩而;N玩Cl，2.smM。保持反应器内恒温于37，C左右。持续充人含5%CO:的02。分别于O，1，4，10，24小时取样。并以前述同样方法检测DZP及其代谢产物浓度和氨浓度。结果在未接种有肝细胞的人工生物肝脏循环器中，DZP浓度无明显降低(P>0.05);在接种有HePGZ细胞的人工生物肝脏循环器中，DZP浓度有降低，然而无统计学意义(P>0 .05)，且无NDZP，TZP和OZP被检测到(图14)。在接种有HePGZ一GS一3A4细胞的人工生物肝脏循环器中，DZP浓度明显降低(P<0.05)。且有NDZP、咒P产生，咒P产量约为NDZp的5倍。DZp被代谢约542林g，NDZp、化p分别86.2、440·4林g产生。DZP浓度约降低18 .1%，开始的4小时内平均速度为0.0180p岁扮eell，而24小时平均速度为0.01 14p扩h/eell。 在未接种有肝细胞的人工生物肝脏循环器中，氨浓度无明显降低(P>0.05);在接种有HePGZ细胞的人工生物肝脏循环器中，氨浓度有降低，然而无统计学意义(P>0.05);在接种有HePGZ一Gs一3A4细胞的人工生物肝脏循环器中，氨浓度明显降低(P<0.05)。氨浓度约降低31.7%，开始的4小时内