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WRKY是植物基因组中特有的一类转录因子大家族,研究表明植物WRKY家族的不同成员参与了植物生长、发育以及对逆境胁迫应答的调控并在其中起重要的作用。CaWRKY5是辣椒WRKY家族的一个成员,初步研究结果表明该基因的转录表达受高温、盐胁迫以及病原菌侵染等的影响,并在对这些逆境抗性反应中起重要的调节作用,但对其诱导表达的分子机制还不很清楚。为了进一步明确CaWRKY5受逆境胁迫诱导表达的分子基础,本研究从辣椒基因组DNA中分离获得了CaWRKY5的相应启动子,并利用农杆菌介导的烟草叶片瞬间表达系统,通过deletion缺失突变体分析进一步分析了该启动子对不同逆境的应答并分析了可能的顺式作用元件。主要研究如下:
1)利用LA-PCR技术从辣椒基因组DNA克隆得到CaWRKY5基因5端上游-936bp的启动子调控序列。用生物信息学对序列进行分析表明,该启动子TATA框为起始密码子ATG上游-140bp至-136bp的TATATAA,同时含有多种与逆境胁迫相关的顺式作用元件,如W-box,S-box,SA应答元件和类似ABRE元件等。
2)CaWRKYK5基因.936bp启动子是一个完整的启动子区域,具有启动子表达活性。在青枯病病原菌侵染和MeJA诱导作用下,长于-886bp的启动子缺失体都可以激活GUS基因的表达,而-489bp的启动子序列却不足以激活GUS表达,说明启动子应答青枯病菌的核心元件分布在启动子-886bp至-489bp之间。-336bp以上的启动子区域在机械损伤和SA的诱导处理下均可激活GUS基因的表达,说明启动子应答机械损伤和SA的核心区域分布在启动子上游的-336bp的区域里。对启动子4个缺失体进行ET(ethylenetreatment)处理应答分析,发现-936bp和-336bp区域的缺失体均可激活GUS基因表达,而其中的-886bp和-489bp区域的缺失体却不能激活GUS基因的表达,说明启动子应答乙烯的核心区域分布在-336bp至ATG以及-936bp至-886bp的区域,而-489bp至-336bp区域中可能含有对乙烯应答起着负调控的调控元件。