【摘 要】
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目的:研究原代人脐静脉内皮细胞（Primary human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）被2型登革病毒（Dengue virus 2,DENV2）感染后,巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）通过AMPK/ERK/m TOR途径调节自噬的影响。方法:1.常规培养C6/36、HUV
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目的:研究原代人脐静脉内皮细胞（Primary human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）被2型登革病毒（Dengue virus 2,DENV2）感染后,巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）通过AMPK/ERK/m TOR途径调节自噬的影响。方法:1.常规培养C6/36、HUVEC,50%组织细胞感染量(Median tissue culture infective dose,TCID50)检测DENV2对C6/36的毒力,RT-PCR检测DENV2感染细胞内NS1基因部分序列。2.以雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）处理HUVEC为阳性对照,正常HUVEC为阴性对照,WB检测不同稀释度DENV2感染后,HUVEC自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ的动态变化;筛选适宜感染稀释度,透射电子显微镜观察DENV2感染的HUVEC内自噬小体,RT-qPCR和WB分别检测内源性MIF、LC3-Ⅱm RNA及蛋白水平,Pearson相关系数分析MIF与LC3-Ⅱ的相关性。3.氯喹（Chloroquine,CQ）处理HUVEC作为自噬抑制对照,MIF抑制剂ISO-1和通路抑制剂Compound C、U0126分别预处理HUVEC,WB检测DENV2感染的HUVEC内MIF、p-AMPK、p-ERK、p-m TOR、LC3-Ⅱ蛋白水平,分析MIF与AMPK/ERK/m TOR通路的关联。结果:1.实验用毒株对C6/36细胞的TCID50为10-9.09/ml,DENV2感染的C6/36、HUVEC内可检测到病毒NS1基因部分序列片段。2.10~3、10~4、10~5TCID50三种稀释度DENV2感染HUVEC后不同时间,LC3-Ⅱ蛋白水平高于空白组,其中10~5TCID50感染组LC3-Ⅱ蛋白水平和变化趋势最明显,从12h开始增加,48h达到峰值,随后下降（p＜0.05）,与RAPA阳性对照组相似。DENV2感染24、36h后,在HUVEC胞质形成自噬小体和自噬溶酶体,自噬水平有差异;而正常HUVEC未见自噬小体和自噬溶酶体。3.内源性MIF和LC3-Ⅱm RNA水平从12h到36h呈现增加趋势,两者呈正相关（p＜0.05）;蛋白变化趋势呈现先增后减,内源性MIF蛋白在36h达到峰值,LC3-Ⅱ在48h达到峰值（p＜0.05）。4.MIF抑制剂预处理后,与仅感染组相比,36、48h内源性MIF蛋白水平下降（p＜0.05）,且AMPK、ERK的活性受到抑制（p＜0.05）,LC3-Ⅱ蛋白水平在48h明显下降（p＜0.05）。而AMPK或ERK通路抑制剂预处理后,与仅感染组相比p-AMPK、p-ERK水平下降（p＜0.05）,但对内源性MIF蛋白表达水平的影响不明显。结论:本研究证实HUVEC被不同稀释度DENV2感染后,10~5TCID50 DENV2激活自噬较为显著;内源性MIF正调节LC3-Ⅱ水平;内源性MIF的抑制可下调AMPK/ERK/m TOR通路活性、自噬活性,提示DENV2感染HUVEC引起内源性MIF变化可影响自噬水平,并通过调控AMPK/ERK/m TOR途径影响自噬。
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