论文部分内容阅读
第一部分HDM4及其剪切子HDM4-S在白血病中的表达目的：探讨癌基因HDM4及其剪切子HDM4-S在急性髓性白血病(AML)以及慢性髓性白血病(CML)中的表达水平,并检测HDM4-S与FL-HDM4相对比值的变化,了解HDM4在白血病形成过程中的作用。方法：用实时荧光聚合酶链反应(Real-Time PCR)方法检测了36例初治CML、35例AML患者以及15例正常人外周血单个核细胞中HDM4、HDM4-S的mRNA水平,采用2-ΔΔCt法处理实时荧光定量数据,分析白血病患者与正常人HDM4、HDM4-S mRNA表达的变化；另外设计一对可以区分二者的引物,采用普通RT-PCR方法同时扩增基因,根据琼脂糖凝胶电泳条带分析HDM4-S与FL-HDM4比例,并各组比较。结果：(1)AML、CML外周血单个核细胞中HDM4-S、HDM4均表达,HDM4的表达水平均高于正常人的表达(p<0.05),而HDM4-S的表达与正常人水平相比无明显变化(p>0.05)。(2)在正常人中,HDM4-S/FL-HDM4接近并小于等于1；在二种髓性白血病中,大多数还是以FL-HDM4为主,HDM4-S/FL-HDM4比例范围比较广；(3)某些白血病标本可见HDM4-S/FL-HDM4明显较大,CML中有8.57%(3/35)、AML中有16.7%(6/36)表现为HDM4-S/FL-HDM4>1。结论：HDM4基因的高表达与髓性白血病的形成有关；虽然HDM-S的水平没有明显变化,与HDM4-S/FL-HDM4比例的变化显著,可能与在白血病发生有关,在白血病的诊断中较单个剪切子的变化更有意义。第二部分HDM2/HDM4-S基因真核表达载体的构建与转染目的：构建并鉴定真核表达载体pEGFP-C2-HDM2、pEGFP-C2-HDM4-S,并将重组质粒转染入人肝母细胞瘤细胞株HepG2、人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞中,筛选出阳性细胞克隆。方法：应用分子克隆技术将HDM2、DM4-S全长cDNA片段插入到真核表达载体pEGFP-C2,经双酶切、菌落PCR及测序鉴定,构建分别包含目的基因HDM2、HDM4-S的重组质粒pEGFP-C2-HDM2、pEGFP-C2-HDM4-S。利用脂质体介导pEGFP-C2-HDM2、pEGFP-C2-HDM4-S质粒分别转染到HepG2细胞、HUVEC细胞,荧光显微镜观察各组细胞的转染效率,并采用含G418的培养基筛选以获得稳定转染了HDM2、HDM4-S的阳性细胞克隆。结果：(1)通过酶切、PCR鉴定、测序证实已经成功构建能够稳定表达和具有筛选特征的pEGFP-C2-HDM2、pEGFP-C2-HDM4-S质粒载体。(2)转染后经荧光显微镜检查可见pEGFP-C2-HDM2、pEGFP-C2-HDM4-S表达绿色荧光蛋白的阳性表达细胞,并采用G418筛选获得了足够数量阳性克隆的含野生型HDM2、HDM4-S的转染细胞。结论：成功构建真核表达载体pEGFP-C2-HDM2、pEGFP-C2-HDM4-S,通过G418筛选获得的阳性克隆细胞,可供后续研究使用。第三部分HDM2、HDM4-S的高表达对不同细胞中p53-HDM2-HDM4通路的影响目的：探讨在HDM4不同剪切状态下,高表达外源性的HDM2、HDM4-S对其选择性剪切状态的影响,以及HDM4-P53通路上的蛋白表达的变化。方法：提取稳定转染了MDM2、HDM4-S的转染细胞进行RT-PCR和WB反应,检测MDM2、HDM4-S变化,以及通路中蛋白质的变化。结果：在HepG2细胞模型中,高表达HDM2与高表达HDM4-S组中,FL-HDM4基因表达受到抑制,HDM4-S/FL-HDM4比率显著增加；蛋白质表达情况：除了P21有明显改变,表现为依次增加趋势,P53和HDM4没有很大变化。在HUVEC模型中,HDM4基因表达也受到抑制,HDM4-S/FL-HDM4比率也显著增加各组蛋白质表达情况变化更为明显,表现为：HDM4蛋白出现截短的异常剪接产物,但是在高表达HDM2和HDM4-S基因之间没有区别；P53水平依次降低；P21的水平依次增加。讨论：在受外源性HDM2与HDM4-S影响下,HDM4-S与FL-HDM4的比例均发生变化,而且在不同的细胞状态下反应性变化也不同,因此,HDM4参与细胞稳态的维持,并且HDM4的选择性剪切子的变化是其机制之一。