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研究目的: 验证HGF对DCs免疫功能的抑制。将含NK4基因的重组腺病毒Ad-NK4转染DCs,观察Ad-NK4逆转HGF对树突状细胞免疫功能抑制,为开发DCs疫苗治疗MM提供新思路和策略。 方法: 取健康志愿者的外周血,密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMNCs),采用CD14磁珠分选收获的PNMNCs。收获的CD14+的PBMNCs,用100 ng/ml(终浓度)rhGM-CSF和50 ng/ml(终浓度) rhIL-4诱导分化为DCs。以Ad-NK4和Ad-GFP转染DCs,确定合适的感染复数(multiplicity of infection, MOI),通过流式细胞术、Western Blot和PCR验证Ad-NK4对DC的转染效率。设立4个分组:空白对照组为未转染腺病毒的DCs,不用HGF处理;3个实验组在培养基中加入50 ng/ml(终浓度)HGF,分别为未转染腺病毒的DCs组(HGF组)、转染Ad-GFP的DCs组(HGF+Ad-GFP组)和转染Ad-NK4的DCs组(HGF+Ad-NK4组)3组。收集培养的细胞做以下检测:(1)收集培养至第5天的细胞,即未成熟DCs(immature dendritic cells, imDCs),调节细胞数为2×105/ml与FITC-dextran(1 mg/ml)混匀后在37℃培养箱中培养2 h,PBS洗涤,流式细胞仪检测的dextran阳性的细胞(%),作为DCs吞噬能力的指标;(2)收集imDCs,用流式细胞仪检测表面分子CD209、CD206及 CD16;(3)收集各组imDCs,检测表面分子CD40、CD80和CD86;(4)培养第5天,在培养基中加入TNF-α,至第7天收集细胞,为成熟DCs(mature dendritic cells, mDCs),检测表面分子CD40、CD80和CD86;(5)Transwell细胞迁移实验检测各组imDCs的迁移能力;(6)明胶酶谱检测金属机制蛋白酶MMP2和MMP9活性;(7)Western Blot检测MMP2和MMP9蛋白表达。 结果: (1)PBMNCs经过GM-CSF和IL-4诱导分化后可以获得具有免疫表型特征的DCs,在TNF-α刺激后,DCs在显微镜下可看见明显树突样突起,表现出典型的细胞形态。(2)Ad-NK4对DCs有着较高的感染率,其中合适的感染复数是100 MOI。(3)HGF能够抑制imDCs摄取抗原的能力,HGF组和空白对照组分别为26.50±4.78和72.53±3.42(P<0.01),Ad-NK4能够拮抗HGF对imDCs摄取抗原的能力的抑制,dextran阳性率为70.56±3.46(P<0.05)。(4) HGF能够下调抗原吞噬相关分子CD206(HGF组vs空白对照组:36.43±6.45 vs54.40±8.72,P<0.05)和CD16(HGF组vs空白对照组:24.25±7.56 vs38.03±4.96,P<0.05)的表达率;Ad-NK4能够逆转HGF的作用,CD206和CD16的表达率分别为56.23±4.48(P<0.05)和31.43±3.79(P<0.05)。(5)HGF能够降低mDCs抗原提呈相关分子CD80(HGF组vs空白对照组:40.28±6.52 vs80.48±11.2,P<0.05)及CD86(HGF组vs空白对照组:34.36±7.56 vs76.01±10.23, P<0.05)的表达率,Ad-NK4能够逆转HGF的作用,CD80和CD86分别为78.3±4.48e(P<0.05)和69.43±8.79(P<0.05)。(6)细胞迁移实验提示,HGF能够促进DCs迁移,HGF组和空白对照组迁移细胞数分别为18.49±1.97和20.34±2.13(P<0.05),但差值很小,实际意义不大。HGF+Ad-NK4组为20.34±2.13,与HGF组比较无显著差异(P>0.05)。(7)明胶酶谱和Western blot结果都提示HGF提高DCs中MMP9的活性,Ad-NK4抑制HGF的作用。 结论: (1) Ad-NK4能够有效感染DCs。 (2) HGF降低imDCs的抗原吞噬能力及抗原吞噬相关分子CD206和CD16的表达,Ad-NK4能够逆转HGF对imDCs吞噬能力的抑制。 (3) HGF能够抑制mDCs抗原提呈相关分子的表达,Ad-NK4能够逆转此抑制作用。 (4) HGF促进imDCs的迁移作用不明显。 (5) HGF能够提高mDCs MMP9的活性,Ad-NK4逆转HGF对MMP9的活化。