论文部分内容阅读
鸭疫里默氏杆菌是黄杆菌科鸭疫里默氏杆菌属的代表种,黄杆菌科是拟杆菌门最大的一个分支,目前鸭疫里默氏杆菌已成为危害养鸭业的主要病原之一,不仅感染鸭、火鸡,其他畜禽如鸡、鹅等也容易受到感染。病鸭死亡率高、生长迟缓、饲料转化效率低、品质下降、疾病治疗等,给养殖业造成了巨大的经济损失。控制该病的方法主要是注射疫苗和应用抗菌药物,其中红霉素已在临床上成功应用于该病,但是近些年红霉素治疗失败的案例已经被多次报道。近年来分离出来的具有红霉素抗性的鸭疫里默氏杆菌比例逐渐增加,而鸭疫里默氏杆菌的红霉素抗性机制还未被报道。故本试验重点研究鸭疫里默氏杆菌对红霉素的耐药机制。本研究以先采用微量肉汤稀释法分别检测了1996年至2014年本实验室自临床病死鸭分离的79株鸭疫里默氏杆菌及一株鸭疫里默氏杆菌型菌株ATCC11845的最小抑菌浓度(MIC),结果表明检测的80株鸭疫里默氏杆菌中有43株具有红霉素抗性,占53.8%,37株为红霉素敏感菌株,占46.2%。此外,2005—2014年自病鸭分离的56株鸭疫里默氏杆菌中有41株为红霉素耐药菌,占73.2%(41/56);而1996—2004年自病鸭分离的24株鸭疫里默氏杆菌中只有2株为红霉素耐药菌。为了确定所携带红霉素基因的类型,通过PCR检测耐药菌株的ermF基因,结果表明,具有红霉素抗性的43株鸭疫里默氏杆菌中有30株携带有ermF或ermFU基因,MIC在32~2048mg/L;具有emF+红霉素抗性的30株菌中有27株携带ermFU基因,占90%(27/30);另外3株菌携带有ermF基因。另外,其余13株红霉素抗性的鸭疫里默氏杆菌携带有ereD基因,MIC在4~16 mg/L。克隆不同ermF+阳性菌株的ermF/ermFU基因并进行序列分析,结果表明其氨基酸同源性高达98.5%-100%。对鸭疫里默氏杆菌菌株HXb2、GuiZ-1、YXb15、HGb1、NJ-4、JY-6、YZ-1、ZJb2分别通过基因组步移法扩增ermF基因及其侧翼序列,结果显示,鸭疫里默氏杆菌与CTnDOT的ermFU基因的上游序列有85.8%-88.7%的同源性,因此推测ermFU基因可能是来自CTnDOT转座子元件;而鸭疫里默氏杆菌的ermF基因的上游(-1至-600)与转座子Tn4351中的ermF基因相应区域相比较同源性较高,仅有几个核苷酸的差异,因此推测ermF基因可能来自于转座子Tn4351。此外,序列分析显示ermF、ermFU和ereD基因存在于鸭疫里默氏杆菌基因组的多重耐药区(MRR)。为了进一步确定ermF、ermFU和ereD基因能否引起鸭疫里默氏杆菌的红霉素耐药,将分别携带有ermF、ermFU和ereD基因盒的重组穿梭质粒转入到红霉素敏感菌株CH3中。结果显示,三株重组菌CH3(pRES-HXb2-ermFU),CH3(pRES-YZ-1-erm F)和CH3(pRES-SX-ere D)均具有红霉素抗性,其中携带有ermF或ermFU的两个重组菌株CH3(pRES-HXb2-ermFU)和CH3(pRES-YZ-1-ermF)对林可霉素具有较高的抗性,而CH3(pRES-SX-ereD)对林可霉素同野生株一样对红霉素敏感。荧光定量PCR显示,三株重组菌CH3(pRES-HXb2-ermFU),CH3(pRES-YZ-1-erm F)和CH3(pRES-SX-ere D)中ermFU、ermF和ereD的m RNA相对表达量分别较野生株HXb2、YZ-1和SX高3.3、80和6.7倍。以上结果表明,鸭疫里默氏杆菌多重耐药区(DRR)中的ermF、ermFU或ereD基因可引起鸭疫里默氏杆菌的红霉素耐药。