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目的利用CRISPR/Cas9技术对狨猴抑郁症易感基因在细胞及胚胎水平进行编辑,为基因修饰狨猴抑郁症模型或易感模型的建立提供基础;制备辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体,为狨猴免疫学检测体系提供资源。方法(1)对狨猴皮肤、肾脏、肝脏、心脏及肺脏组织的进行体外培养。(2)细胞水平的验证:抑郁症易感基因SIRT1、SLC6A4、LHPP、HTR1A、MTHFR的10个sgRNA,与Cas9/ABE/CBE质粒转染狨猴肾脏细胞,抗性筛选后提取基因组,对PCR扩增目的片段,测序及T7E1酶切片段检测基因突变率。(3)胚胎水平的验证:ELISA检测狨猴血清中的孕酮含量,确定月经周期;rhFSH+hCG超数排卵;卵泡穿刺采集卵母细胞;IVM获得成熟卵母细胞;直肠电刺激技术/阴茎震荡技术采集精子;IVF获得受精卵;选择4个基因敲除效率较高的8个sgRNA进行受精卵注射,提取基因组,扩增目的片段并测序。(4)亲和层析法和SDS-PAGE电泳对血清IgG纯化和鉴定;免疫双扩散法测定抗血清效价,改良过碘酸钠标记法制备兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体,ELISA及Westem-blot法鉴定兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体工作浓度及特异性。结果(1)建立狨猴肾脏细胞培养、转染及抗性筛选体系:其F2-F5代细胞生物性状稳定,可用于后续细胞实验;Viafect比Lipo2000更适合狨猴肾脏细胞转染;细胞抗性筛选适宜浓度嘌呤霉素4μg/ml,杀稻瘟菌素8μg/ml。(2)CRISPR/Cas9介导的狨猴细胞水平的验证有效:测序结果显示,sgRNA的PAM序列附近开始出现杂峰,10个sgRNA均引入突变;单核苷酸替代ABE有三个位点有突变,突变率很低<10%;CBE无突变。选择基因编辑效率高的CRISPR/Cas9作为基因修饰抑郁症模型构建的基因编辑技术。(3)狨猴的月经周期检测结果:狨猴月经周期约27.68±4.76d,其中卵泡期约9.56±2.95d,黄体约18.12±3.96d,其卵泡期较短,3-11月适宜做超排实验。(4)狨猴精子采集技术:对比两种精子采集技术,采用精子活性高直肠电刺激技术。(5)CRISPR/Cas9技术介导的狨猴胚胎上水平的验证有效:将sgRNA与Cas9蛋白一起进行受精卵原核注射,除LHPP的1对sgRNA未引入突变,MTHFR、HTRIA、SLC6A4 基因突变率约为 41.6%、30%、41.6%,CRISPR/Cas9 技术成功引入突变胚胎占检测胚胎总数的75%。(6)血清IgG≥95%;抗血清效价1:64;ELISA与Western-blot参考工作浓度分别为1:256000与1:15000。结论 建立狨猴肾脏细胞培养、转染、筛选体系;CRISPR/Cas9介导抑郁症5个易感基因在细胞水平编辑;CRISPR/Cas9技术可以应用对狨猴胚胎进行编辑;对狨猴辅助生殖技术进行完善及数据补充,实现了 CRISPR/Cas9技术在细胞与胚胎水平的初步验证。制备了狨猴IgG-HRP标记抗体,为狨猴病原体免疫学检测体系及分子免疫学检测体系储备了资源。