研究背景：Wnt蛋白是分泌型糖蛋白,能够激活不同的信号通路,包括经典Wnt/β-catenin信号通路,非经典的Wnt/PCP 和 Wnt/Ca2+通路。研究发现,Wnt信号通路在胚胎发生和神经系统发育中发挥了重要作用,如突触发生,树突形态构建以及海马等结构的形成中。Wnt/β-catenin信号通路与成年海马中的神经再生也密切相关。而神经再生在抑郁症的发生、发展及治疗中至关重要,提示Wnt信号通路可能参与抑郁过程中。有文献报道Wnt信号通路下游信号分子如GSK-3β等在抑郁症的发病及其治疗中发生明显变化并参与其中。但是关于Wnt分子是否参与抑郁症的发生的直接证据很少。应激是导致抑郁症发生的一个重要因素。研究发现Wnt受体及其Wnt下游信号通路分子也参与到应激过程中,例如慢性不可预见性应激会使海马中Wnt受体Frizzled 6 (Fzd6)表达减少；在慢性社交挫败应激的小鼠中,Wnt下游信号通路的关键性分子disheveled-2 (DVL2)在伏隔核部位表达下降。最近有报道发现急性和慢性应激能够增加Wnt信号通路下游的抑制分子Dickkopf-1 (Dkk-1)在海马中的表达。以上都是基于对Wnt信号通路分子做的研究。但是,Wnt分子作为激活Wnt/β-catenin信号通路的配体是否直接参与到应激中目前还不清楚。本课题中,我们采用慢性束缚应激(CRS)模型,运用动物行为学测试和分子细胞生物学等方法,系统地研究是否有Wnt分子参与到CRS引起的抑郁行为中以及Wnt分子参与CRS引起的抑郁行为的具体机制。目的：1.探究有无Wnt分子参与CRS引起的抑郁行为。2.探究Wnt分子参与CRS引起的抑郁行为的机制。方法：1.慢性束缚应激(CRS)小鼠每天从上午8点到10点在通风聚丙烯束缚管中束缚应激2小时,连续14天。2.脑立体定位和病毒微量注射小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上。选择腹侧海马注射病毒,注射量为每侧1微升,注射坐标(以前囟点为零点)如下：前后,-2.8毫米；左右,±2.5毫米；背腹侧,-2.3毫米。3.行为学测试3.1旷场实验本课题中利用旷场实验测试小鼠的自主运动能力。小鼠被放进旷场中央区,检测10分钟内的运动总距离作为评价其自主运动能力的指标。3.2蔗糖偏好实验在CRS最后一天,从晚上8点开始对小鼠饮水进行控制。适应阶段小鼠只有在早上8点到9点可饮用1%的蔗糖水,适应3天。测试阶段在8点到9点分别给予小鼠一瓶1%的蔗糖水和一瓶水,测试时间为2天,检测两天内蔗糖水和水的饮用量。蔗糖偏好指数表示为：蔗糖的摄入量／水和蔗糖摄入总量×100%。3.3强迫游泳实验强迫游泳实验是在一个玻璃容器中进行(25厘米高,直径10厘米,水温22度,水深18厘米),将小鼠放入容器中观察6分钟的不动时间。不动定义为身体静止,只有尾巴或前爪小幅度的运动以保持头部露出水面。3.4悬尾实验将小鼠尾端悬挂在特定装置上观察6分钟,记录不动时间。4.BrdU注射和免疫组织化学染色对于细胞增殖的分析,小鼠腹腔注射50 mg/kg的溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)一次,2小时后灌注。对于神经元存活的分析,小鼠每24小时给予一次共4次BrdU注射,4周后进行灌注。小鼠用5%的水合氯醛麻醉并用4%的多聚甲醛(PFA)灌注和后固定。脑片切成30微米用于免疫组织化学染色。BrdU的一抗使用浓度为1：500,NeuN的一抗使用浓度为1：1000。免疫组化染色的脑片用共聚焦显微镜拍照并用于BrdU阳性细胞数目统计以及BrdU和NeuN双阳性细胞数目统计。5.实时定量PCR实验提取组织总RNA并反转录成cDNA。采用SYBR Green荧光标记法实时定量PCR检测目的基因和内参β-actin的mRNA表达水平。6.蛋白提取和蛋白印迹实验小鼠脑组织样品经裂解液裂解后提取总蛋白并检测蛋白浓度。样品用蛋白印迹实验进行检测,用Quantity one软件进行统计分析。结果：1.CRS能导致小鼠腹侧海马Wnt2和Wnt3表达的降低。为了研究Wnt分子在CRS中的作用,我们利用实时定量PCR和Westernblot的方法检测在海马脑区(背侧海马和腹侧海马)分布较多的Wnt分子的mRNA及蛋白的表达变化. Real-time PCR结果表明在6种Wnt分子中(Wnt2,Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt7a),只有Wnt2和Wnt3在腹侧海马是降低的,而在背侧海马这6种Wnt分子都没有变化。Western blot检测也发现相同的结果。Wnt2和Wnt3在腹侧海马的选择性降低提示我们Wnt2和Wnt3可能参与到CRS引起的抑郁行为中。2.干扰腹侧海马中Wnt2或Wnt3的表达能够模拟CRS引起的抑郁行为。我们用RNA干扰病毒干扰内源性的Wnt2和Wnt3,检测是否会导致抑郁行为发生。结果显示,干扰Wnt2或Wnt3的小鼠表现出蔗糖偏好实验中蔗糖摄入量的减少和强迫游泳实验及悬尾实验中不动时间的增加,能够导致抑郁行为的发生。3.过表达Wnt2和Wnt3能够缓解CRS引起的抑郁行为。我们运用过表达Wnt2和Wnt3的病毒研究Wnt2和Wnt3能否缓解应激引起的抑郁行为。结果显示过表达Wnt2和Wnt3后小鼠能够逆转CRS引起的蔗糖摄入量的减少以及在悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间的增加。表明过表达Wnt2和Wnt3能够缓解CRS引起的抑郁行为,而且同时过表达Wnt2和Wnt3比单独过表达Wnt2或Wnt3抗抑郁效果更明显。4. Wnt/β-catenin信号通路和神经再生参与CRS引起的抑郁行为。我们发现CRS之后Wnt/β-catenin信号通路和神经再生是降低的；干扰Wnt2或Wnt3之后,Wnt/β-catenin信号通路和神经再生也是降低的；而过表达Wnt2和Wnt3之后,CRS引起的Wnt/β-catenin信号通路的损伤和神经再生的损伤能够被逆转。这表明Wnt2和Wnt3通过Wnt/β-catenin信号通路和神经再生参与到CRS引起的抑郁行为中。5.Wnt2和Wnt3能够介导抗抑郁药物的作用。我们发现Wnt2和Wnt3在抑郁行为中发挥了重要作用,那么Wnt2和Wnt3是否参与一些抗抑郁药的作用过程?本课题中,我们选择抗抑郁药物——氟西汀作为研究。我们发现氟西汀腹腔注射2周可以缓解抑郁行为并能够逆转CRS引起的Wnt2和Wnt3的减少。用慢病毒干扰Wnt2或Wnt3后能够减弱氟西汀的抗抑郁作用。结论：1.腹侧海马中Wnt2和Wnt3表达的降低参与到CRS引起的抑郁行为的发生。2.腹侧海马Wnt2和Wnt3通过Wnt/β-catenin信号通路和神经再生的机制参与抑郁发生。3.腹侧海马Wnt2和Wnt3在氟西汀的抗抑郁作用中发挥重要作用。意义：本课题中,我们发现了Wnt分子参与CRS引起的抑郁行为的直接证据,并阐明了其具体机制。为将来抑郁症的治疗提供了新思路和新方法。