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免疫系统的活化,最根本的事件是免疫细胞识别病原体(抗原或者病原体模式分子)之后,诱导细胞内的信号传导,激活免疫细胞的特异功能。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是介导这一过程的一类重要模式识别受体,如TLR4能识别细菌来源的LPS,从而激活抗原递呈细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。和其它免疫反应一样,TLR介导的信号传导和细胞激活过程受到多个层面的调节,以保证不会因为其活化过度而损伤到宿主自身。很多类似调节是一种负反馈调节,即TLR能诱导一些调节因子的表达,这些调节因子反过来能抑制TLR信号,所以许多具有调节作用的分子都是TLR信号的靶基因。从寻找TLR4信号激活诱导的基因着手,研究参与TLR4信号传导和调节的基因。利用了生物信息学分析寻找到一些基因表达受到TLR4信号特异激活的分子,并进一步分析它们的生物学功能。CLEC16A是我们从LPS激活的小鼠脾脏细胞中筛选出来的一个基因,它的表达在受到LPS刺激后显著增加,预示着它可能在TLR信号传递和树突状细胞的活化和生物学功能起到调节作用。暂时还没有文献报道对CLECl6A基因功能学的研究,本课题组采用一些初步的实验方法,来研究CLEC16A蛋白在细胞内的定位以及它与其他未知蛋白的相互作用。
方法:PCR扩增CLEC16A截短后片段及全长,利用限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ将其连接至载体pGEX-4T-3,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,利用GST pull down实验固定谷胱甘肽珠子,钓取目的蛋白,之后将钓取到的目的蛋白酶解后送去做质谱分析。根据文献得知,在果蝇中CLEC16A的同源基因EMA,与Vps16,Vps18,Vps33a之间存在相互作用,采用Co-IP的方法来验证CLEC16A与它们之间是否也存在相互作用。免疫荧光实验检测CLEC16A在HEK293细胞内的定位。结果:CLEC16A基因的截短片段及全长成功连接至载体pGEX-4T-3,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白。质谱分析GST pull down拉下许多与之相互作用的蛋白。Co-IP验证CLEC16A与Vps16,Vps18,Vps33a确实存在相互作用。从免疫荧光实验可以看出CLEC16A部分定位于内质网,高尔基体,溶酶体及晚期内体。