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目的肿瘤的侵袭和转移是肿瘤发展过程中的一个重要组成部分，也是威胁患者生命的主要原因。肿瘤细胞要实现侵袭和转移，必须首先突破由基底膜（basementmembrane，BM）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）构成的组织屏障。硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate protoglycan，HSPGs）是ECM，特别是BM的主要成分，由一个蛋白核心和多个与之共价连接的硫酸乙酰肝素（heparansulfate，HS）侧链组成。HS可以作为复合受体同细胞表面的分子形成受体复合物促进信号转导。并且HS结合大量生物活性分子（包括生长因子，化学增活素，细胞因子等），调控它们的活性和功能，对血管形成，细胞黏附和运动产生影响。因此，HS的降解在癌细胞的侵袭和转移中起到重要作用。肝素酶（heparanase，Hpa）是一种葡糖苷酸内切酶，可以特异性切割HSPGs的HS侧链，并能协同多种生物因子（如bFGF、VEGF等），通过多条途径直接和间接地促进肿瘤的生长、侵袭和转移，因而成为近年来肿瘤转移机制和对策研究的热点。本研究探讨Hpa在不同转移潜能人肺癌细胞系中的表达，分析它与肺癌细胞转移潜能的关系；采用基因重组技术构建Hpa反义真核表达质粒pEGFP-C1-ASHpa，通过转染Hpa高表达的肺癌细胞系，抑制Hpa在肺癌细胞中的表达，观察其对肺癌细胞生物学特性的影响，为肺癌基因治疗提供一定的理论依据。实验材料与方法1、用含有10％胎牛血清的RPIM1640培养基，37℃、5％CO2的培养箱内培养人肺巨细胞癌PG细胞系的高转移潜能细胞亚系BE1、低转移潜能细胞亚系LH7和人肺腺癌低转移潜能细胞系A2。细胞爬片免疫组化染色：分别培养三种细胞制作细胞爬片，85％冷乙醇固定15min，TritonX-100处理。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）观察Hpa蛋白表达情况。RT-PCR：收集三种细胞，提取总RNA并反转录成cDNA，PCR扩增Hpa，产物长度180bp，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测观察。以β-actin为内参，计算Hpa mRNA相对表达量。Western blot：分别提取三种细胞蛋白，采用考马斯亮兰法进行蛋白定量。取等量蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和转印，Hpa一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗孵育后DAB显色。以β-actin为内参，计算Hpa蛋白相对表达量。2、pcDNA3-Hpa质粒含有1758bp的人Hpa cDNA片段，位于EcoRⅠ和XhoⅠ内切酶之间，空载体pEGFP-C1含有XhoⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，可以作为HpacDNA片段的反向克隆载体使用。分别酶切回收Hpac DNA片段和线性化的空载体，二者进行连接反应合成反义Hpa cDNA重组真核表达质粒pEGFP-C1-ASHpa。稳定转染Hpa高表达的人肺巨细胞癌PG细胞系的高转移潜能细胞亚系BE1细胞，转染步骤按照转染试剂的说明书进行，含600μg／mlG418的RPIM 1640筛选培养基培养转染细胞。以未转染的BE1细胞和转染空载体pEGFP-C1的细胞（称为BE1-Em）作为对照。RT-PCR和Western blot挑选BE1细胞经过稳定转染pEGFP-C1-ASHpa质粒后的Hpa低表达细胞克隆，称此为BE1-ASHpa细胞。免疫荧光：观察转染前后Hpa蛋白变化。分别将转染组和对照组细胞接种24孔细胞培养板，4％多聚甲醛室温固定15min后，TritonX-100处理，血清封闭后，滴加Hpa一抗，4℃孵育过夜。避光加罗丹明（TRITC）标记二抗，DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察。细胞计数法：0.5×104／孔的细胞数接种细胞于24孔培养板内，连续6天分别计数各组细胞总数，观察转染组和对照组细胞的生长情况。MTT比色法：1×104／孔的细胞数分别接种转染组和对照组细胞于96孔细胞培养板内，酶标仪机检前加入MTT培养细胞4h，DMSO溶解沉淀颗粒，连续4天检测各组细胞的吸光度值，绘制细胞增殖曲线。流式细胞术：分别收集转染组和对照组细胞，95％乙醇固定，将细胞密度调整至1×106／ml，PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化，Modfit LTV3.0软件分析结果。细胞体外侵袭能力与运动能力检测（Transwell小室法）：接种各组细胞分别至Matrigel包被和未包被的含有微孔滤膜的Transwell小室，37℃、5％CO2分别培养24h和10h后，甲醇室温固定10min，苏木素染色后显微镜下观察细胞体外侵袭能力和运动能力的改变情况。Western blot：步骤同上，所用一抗为VEGF、VEGF-C、pAkt和Akt的一抗。以β-actin为内参，计算各指标蛋白的相对表达量。3、使用SPSS13.0统计软件进行数据处理，以P＜0.05为有统计学意义。实验结果1、Hpa在三种不同转移潜能的肺癌细胞系中均有表达，但表达水平存在一定差别。细胞爬片进行免疫化学染色可见：三种肺癌细胞中均有Hpa蛋白表达，位于胞质内的棕黄色颗粒为阳性信号，但是在不同转移潜能的细胞系中其表达水平存在一定差别：人肺巨细胞癌PG的高转移亚系细胞BE1中的染色强于其它两种细胞系。Western blot结果显示BE1细胞中Hpa蛋白表达量（0.993±0.029）约为LH7细胞（0.529±0.011）的1.8倍（P=0.002），A2细胞（0.599±0.017）的1.7倍（P=0.007）。Hpa mRNA检测表明，LH7细胞的表达量（0.356±0.017）和A2细胞的表达量（0.360±0.011）低于BE1细胞（0.600±0.014）（P=0.002，P=0.005）。2、带有Hpa cDNA片段的pcDNA3质粒进行限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收Hpa片段，pEGFP-C1载体用相同双酶切线性化处理后与Hpa片段进行连接、转化后，得到Hpa反义cDNA表达质粒pEGFP-C1-ASHpa。Hpa高表达肺癌细胞系BE1细胞稳定转染Hpa反义cDNA质粒pEGFP-C1-ASHpa后，经过筛选得到Hpa表达受到明显抑制的细胞BE1-ASHpa，其mRNA和蛋白的相对表达量（0.211±0.009，0.539±0.012）与BE1细胞（0.496±0.013，1.277±0.017）相比，分别下降57.5％和57.8％。3、BE1细胞转染pEGFP-C1-ASHpa后，细胞的增殖能力减弱，细胞凋亡率增加。细胞计数和MTT法检测结果表明BE1-ASHpa细胞的增殖能力低于对照组细胞（P＜0.05）。流式细胞仪检测发现BE1-ASHpa细胞的凋亡率增加，为7.72±0.11％，与BE1细胞相比（0.02±0.01％），差异有显著性（P=0.000）。同时，G1期细胞数百分比增加，为63.27±2.06％，S、G2期细胞数百分比减少为36.73±2.06％，与BE1细胞相比（41.28±0.98％，58.71±0.98％），差异有显著性（P=0.006）。4、BE1细胞转染pEGFP-C1-ASHpa后，细胞的体外侵袭能力和运动能力减弱。TranswelL小室检测细胞体外侵袭和运动能力实验发现，BE1-ASHpa细胞的侵袭和运动能力都明显降低，侵袭实验细胞数为12.00±1.41，运动能力实验细胞数为20.67±1.63，与BE1细胞相比（49.71±3.48，62.83±3.60），差异均有统计学意义（P=0.000，P=0.000）。5、BE1细胞转染pEGFP-C1-ASHpa后，随Hpa的表达下降，细胞的pAkt、VEGF和VEGF-C的表达减弱，而Akt的表达水平无变化。pAkt、VEGF和VEGF-C在BE1-ASHpa细胞中的表达量均低于BE1细胞和BE1-Em细胞，差异有显著性（P＜0.01），而三者的Akt表达水平无明显差异（P＞0.05）。结论1、在所检测的肺癌细胞系中Hpa均有表达，且其在肺癌细胞中的表达与肺癌细胞的转移潜能有关。2、反义Hpa cDNA重组真核表达质粒pEGFP-C1-ASHpa构建成功，稳定转染Hpa高表达肺癌细胞后，可以有效抑制细胞的Hpa mRNA和蛋白表达水平。3、抑制Hpa表达能够抑制肺癌细胞增殖，并诱导肺癌细胞凋亡，可能与Akt的磷酸化水平有关。4、抑制肺癌细胞Hpa的表达水平，可以降低肺癌细胞的侵袭和迁移能力。