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本论文中,以毛白杨为实验材料,克隆了毛白杨木质素合成途径的PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸-4-羟基化酶)、CCR(肉桂酰辅酶A还原酶)、CCOAOMT(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)这四个酶的基因表达序列。构建了这四个酶基因相应的原核表达载体,成功完成了C4H、CCR、CCOAOMT这三个酶的基因在大肠杆菌中的原核表达,建立了其相应的纯化体系。HPLC-MS检测了CCR的蛋白质序列,序列检测结果同我们的模版CCR蛋白质序列的相似性达到了26.6％,证实大肠杆菌中表达的CCR蛋白即是我们的目标蛋白。其中CCR酶学反应检测的底物是以4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)酶学反应催化的产物经C-18柱回收并HPLC-MS检测为上述4CL酶学反应的产物。CCR酶学体系反应后,GC-MS检测证明CCR对4CL催化4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸的相应产物辅酶A酯都有很高的活性区别与之前从一个p.trichocarpa中克隆的CCR(此酶对4-香豆酰辅酶A酯没有活性)。此实验中建立了4CL的产物回收纯化体系和CCR反应无标准样品得情况下的鉴定方法。以4CL酶学反应产物咖啡酰辅酶A为底物检测CCOAOMT的活性,发现其具有将咖啡酰辅酶A转化为阿魏酰辅酶A的活性。但是从大肠杆菌中纯化出的C4H并没有将肉桂酸羟基化为4-香豆酸的活性,我们认为可能是由于大肠杆菌中没有可以提供给C4H反应中需要的CPR及C4H在大肠杆菌的表达中不能得到如同在真核细胞中有一些后期的加工修饰。PAL、C4H、CCR和CCOAOMT在p.trichocarpa基因组中比对后发现这几个基因都是以基因家族的形式存在,数据分析发现杨树基因组中4个PAL基因,3个C4H基因,2个CCOAOMT基因和8个CCR同源基因。。本论文同时克隆了CAD、CCR和COMT的gDNA序列,同实验室克隆的相应cDNA序列进行了比对,分析了其内含子和外显子片段。
综上所述,本研究一次性从我国特有的杨树毛白杨中克隆了参与木质素合成的PAL、C4H、CCOAOMT和CCR四个酶的编码序列,构建了他们相应的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了表达,建立了CCOAOMT和C4H的表达纯化体系;成功回收了CCR上游的酶4CL的酶学反应产物并做为CCR酶学反应底物,建立了4CL的产物回收纯化体系,CCR反应无标准样品得情况下的鉴定方法上述实验为毛白杨木质素生物合成途径的研究提供了一定实验基础。同时为今后的进行木质素调节的转基因杨树培育提供了大量的基因材料。并为多个酶同时对植物体木质素的合成进行调节提供了可能性。各个酶在基因组中皆有多于一个的同源基因表明参与木质素生物合成的酶的基因家族的研究将会是今后研究的一个热点。