论文部分内容阅读
肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成，如果能抑制新生血管的形成，肿瘤细胞将发生凋亡或坏死。目前，已有多种抑制新生血管生成的药物用于抗肿瘤的研究。近来发现了一些分离于组织或体液的血管生成抑制物，它们是大分子蛋白的生物活性片断。肿瘤抑素（tumstatin）是继血管生成抑素（angiostatin）和内皮抑素（endostatin）之后，最新发现的源于人基膜ColⅣ的肿瘤新生血管生成的抑制因子，分子量为28kDa，由244个氨基酸组成，包括ColⅣα3的NC1活性区域的232个氨基酸和中间3股螺旋区C-端的12个氨基酸。近来研究表明，Tumstain有两个不同的活性区，一个是N端的54～132氨基酸组成的78肽（tum-5），其中74～98位氨基酸组成的T7肽可通过内皮细胞凋亡，使肿瘤新生血管合成受到抑制，从而抑制肿瘤生长、浸润和转移。另一个是靠近C端的185～203氨基酸组成的19肽，直接作用于肿瘤细胞，抑制其生长。这些作用主要是通过Tumstain和肿瘤新生血管上特异高表达的整合素αvβ3结合来实现的。整合素αvβ3是近来研究较多的一个肿瘤新生血管上较理想的靶位点，由于Tumstain具有与其特异的结合能力，通过用131I、99Tcm等放射性同位素标记Tumstatin，进行肿瘤的放射受体显像，具有重要和潜在的临床应用价值。在本研究中，我们从HEK293细胞中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出人Tumstatin基因，将该基因导入克隆载体pMD19-T中，通过菌落PCR、质粒限制性内切酶鉴定和DNA序列分析，获得重组质粒pMD19-Tumstain，然后亚克隆至表达载体pET28a（+）中，通过菌落PCR、酶切鉴定和序列分析，构建重组表达质粒pET28a（+）-Tumstain，然后将该质粒转化表达菌E.coli BL21（DE3）。分别对IPTG浓度、表达温度、诱导时间和表达部位等表达条件进行了优化，并通过SDS-PAGE和Western Blot来鉴定。对表达的包涵体，通过Ni柱亲和层析来进行纯化。对洗脱下的目的蛋白进行透析复性，BCA法测定重组人Tumstatin蛋白浓度。并通过MTT实验来验证其抑制肿瘤细胞的生物学活性。实验结果表明，提取的RNA经电泳，有明显的28S和18S两条带，且两者亮度约为2：1，表明RNA比较完整，通过紫外测其浓度，RNA的浓度为7.63μg／μl。PCR产物电泳显示在750bp附近有目的条带，表明目的基因得到了扩增。菌落PCR、酶切鉴定和序列分析等结果表明，成功的构建了含有人Tumstatin基因的表达载体pET28a（+）-Tumstatin。SDS-PAGE和Western Blot显示在IPTG诱导下，重组人Tumstatin得到了表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，主要以包涵体的形式存在。优化的最佳表达条件为：IPTG终浓度为1mM，诱导温度为37℃，时间为5hr。SDS-PAGE显示，Ni柱亲和层析时，当洗脱的咪唑浓度为300mM时，目的蛋白被洗脱下来，得到了较纯的蛋白。通过尿素梯度透析复性，得到了一定浓度的蛋白，BCA法测定蛋白浓度为1.73 mg／ml。MTT实验证实了重组人Tumstatin具有抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性。综上所述，在本研究中成功克隆出人Tumstatin基因，重组表达出Tumstatin蛋白，对表达条件进行了优化，纯化和复性条件进行了探索，并对Tumstatin蛋白的抑制肿瘤细胞的生物学活性进行了验证，这些为进一步深入研究人Tumstatin作用机制和肿瘤的放射受体显像奠定了基础。