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随着农药的广泛应用,其环境危害也越来越受到人们的重视。噻呋酰胺作为一种酰胺类杀菌剂,由于其对许多真菌性病害有治疗作用,而得到广泛应用,例如用于麦类和水稻的纹枯病。在田间施用时,可以通过多种途径进入水生环境。因此,对其水生毒性进行评价十分重要。虽然目前其对大型溞等水生生物的毒性有过报道,但是有关噻呋酰胺对斑马鱼的毒性效应以及机制研究还鲜见。本文以斑马鱼为研究生物,结合形态学、病理学、生物化学以及分子生物学手段,探讨噻呋酰胺对不同生命阶段斑马鱼的毒性效应以及毒理机制。1.噻呋酰胺对斑马鱼的急性毒性以及发育毒性噻呋酰胺对斑马鱼成鱼、仔鱼、胚胎均有致死效应,96h-LC50(96小时致死中浓度)分别是4.19 mg/L,3.52 mg/L,3.08 mg/L。可见噻呋酰胺对斑马鱼的三个生命阶段均为中等毒性,且胚胎时期最敏感。此外,斑马鱼的生长发育也受到显著性影响。噻呋酰胺对斑马鱼胚胎发育有一定的抑制作用,可引起发育迟缓,自主运动减弱,心率下降,孵化延迟,甚至产生致畸效应;可致使仔鱼心率下降,运动减弱,生长抑制以及各种致畸效应;抑制成鱼的体重和体长的增长。2.噻呋酰胺对斑马鱼胚胎的毒性机制将胚胎暴露于0,0.19,1.90,2.85 mg/L噻呋酰胺中。四天后用HE(苏木精伊红)染色,以观察噻呋酰胺对斑马鱼胚胎器官发育的影响;进行超薄切片制作,透射电镜下观察噻呋酰胺对斑马鱼胚胎亚细胞结构的影响;同时进行酶活性、相关指标含量的测定,相关基因表达的检测,以明确噻呋酰胺对斑马鱼胚胎的毒性机制。研究发现噻呋酰胺抑制斑马鱼胚胎的器官发育,并对其致畸,损伤斑马鱼胚胎细胞以及细胞器,致使线粒体出现膜消融、嵴降解等现象,细胞出现凋亡坏死等;抑制斑马鱼胚胎中线粒体相关基因的表达,抑制琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性;通过抑制斑马鱼胚胎中抗氧化相关基因的表达以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性,致使斑马鱼胚胎氧化损伤,脂质过氧化,MDA含量显著上调;通过上调凋亡相关基因的表达,活化caspase-3、caspase-9,致使斑马鱼胚胎细胞出现凋亡;通过上调免疫相关基因的表达以及IL-8(白细胞介素8)的含量,激活斑马鱼胚胎的免疫应答。综合试验结果,噻呋酰胺通过抑制斑马鱼胚胎中SDH的活性以及损伤线粒体的结构,引起斑马鱼胚胎出现氧化损伤、细胞凋亡、免疫应答,导致斑马鱼胚胎细胞损伤,斑马鱼出现毒性效应。3.噻呋酰胺对斑马鱼成鱼的毒性机制将斑马鱼成鱼暴露于0,0.19,1.33,2.76 mg/L浓度的噻呋酰胺中,21天后取肝脏、肾脏用于组织切片制作,观察其病变情况。结果发现噻呋酰胺严重损伤斑马鱼成鱼的肝脏和肾脏,且在低浓度即对肝脏产生损伤,具有组织特异性。在此基础上,将斑马鱼成鱼置于0,0.019,0.19,1.90 mg/L的噻呋酰胺中,28天后取斑马鱼肝脏,用于透射电镜切片制作,观察其组织中线粒体结构变化等。结果表明噻呋酰胺严重损伤斑马鱼肝脏细胞以及线粒体,造成线粒体出现肿胀、嵴降解、膜消融等损伤。同时进行SDH以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ-Ⅳ活性的检测,以及凋亡、免疫相关基因表达的检测,结果发现噻呋酰胺显著性抑制SDH以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ-Ⅳ活性,影响凋亡、免疫相关基因的表达。综合试验结果,噻呋酰胺可能是通过抑制斑马鱼SDH以及复合体Ⅰ-Ⅳ活性,以及损伤线粒体结构,影响凋亡、免疫相关基因表达,进而造成肝脏细胞坏死,产生毒性。4.噻呋酰胺对斑马鱼脂类代谢的影响将斑马鱼成鱼置于0,0.019,0.19,1.90 mg/L噻呋酰胺中。28天后取肝脏进行HE染色以及油红O染色,以检测肝脏中脂滴累积情况。结果表明处理组肝脏中并未出现脂滴累积。此外进行甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCHO)含量测定,酶活性检测以及脂代谢相关基因表达的检测。结果表明噻呋酰胺影响脂类相关基因的表达,抑制脂肪酸合成酶(FAS)的活性,增强肉碱脂酰转移酶Ⅰ(CPT-I)的活性,下调TG、TCHO的含量。同时噻呋酰胺可显著性抑制斑马鱼肥满度,上调肝体指数。综合试验结果,噻呋酰胺通过影响脂代谢相关基因的表达,抑制FAS活性,增强CPT-I的活性,促进脂肪的动员,抑制脂类的合成,下调TG、TCHO,造成肥满度下调。5.噻呋酰胺对斑马鱼糖代谢的影响将斑马鱼成鱼暴露于噻呋酰胺(0,0.019,0.19,1.90 mg/L)中,暴露28天后取肝脏进行组织切片制作,观察糖原累积以及分布情况;另进行肝糖原含量以及糖代谢相关基因表达水平的检测;同时检测6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及丙酮酸、乳酸的含量、血糖含量。研究发现噻呋酰胺处理后,斑马鱼肝脏中出现糖原累积,斑马鱼血糖含量下降,同时SDH、LDH活性显著下降,G6PDH活性增强,丙酮酸、乳酸也随之出现相应的变化,糖代谢相关基因的表达亦受到影响。综合试验结果,噻呋酰胺能够改变糖代谢相关基因的表达,通过抑制SDH以及线粒体呼吸链复合体活性,抑制TCA;通过抑制LDH的活性减弱糖的无氧酵解途径;通过增强G6PDH的活性,增强糖酵解的磷酸戊糖途径。从而造成肝糖原累积、血糖含量下降,影响斑马鱼的糖代谢。6.斑马鱼成鱼转录组学分析将斑马鱼成鱼暴露于噻呋酰胺中(0,0.19 mg/L),暴露28天,取其肝脏进行转录组学分析。结果表明噻呋酰胺处理组1942个基因的表达显著受到影响,其中665个基因表达水平上调,1277个基因表达水平下调;富集到KEGG,噻呋酰胺影响氧化磷酸化、糖酵解、代谢等诸多通路。综合转录组学结果,噻呋酰胺通过影响多个通路,造成斑马鱼发育抑制,产生毒性效应,具体机制还需进一步探讨。