棉花是世界性的重要经济作物和纺织工业主要原料。中国是世界产棉和用棉大国,棉花产业对发展国民经济和保障人民生活具有重要的意义。但21世纪以来,随着大量高产转Bt基因棉花品种投入使用,棉花早衰现象日益突出,严重影响了棉花产量和品质的进一步提高。棉花早衰是叶片衰老的表现形式之一,深入研究揭示棉花衰老及其调控机制,实现棉花正常成熟,对提高棉花产量和品质具有重要的理论和实践意义。库源关系影响棉花衰老和成熟,库源比是库源关系的重要指标。棉株的正常生长发育需要一个相对协调的库源系统来维持,由于自身原因(遗传因素)或外界胁迫(人工或环境)使库源比变化,棉株体内衰老相关基因差异表达,会引起早衰等异常熟相。基于此,本研究选择遗传背景相同,而库源比和叶片衰老快慢不同的两个棉花品系(衰老慢的L系和衰老较快的E系)为材料,于2014～2016年在大田种植,相继开展了以下研究:一是比较研究了两个棉花品系的衰老表现(熟相)和库源比,揭示了库源比与叶片衰老的关系;对两个棉花品系不同衰老时期的叶片进行了表达谱测定,发现了大量棉花衰老差异表达基因,明确了部分叶片衰老相关基因的表达模式;其中包括一个ABA受体基因GhPYL8,从两品系中克隆了GhPYL 基因,发现了两品系来源的GhPYL8基因存在3个核苷酸突变,导致了 1个氨基酸位点的突变;利用VIGS基因沉默技术分别在两品系中沉默了GhPYL8基因,初步研究了 GhPYL8基因的功能。二是通过蕾期人工去除棉株基部2～4个果枝改变库源比,从库源关系、激素平衡、衰老相关基因表达等方面进一步揭示了库源比调控叶片衰老的机制。主要结果和结论如下:1.库源比不同是两个棉花品系衰老差异的重要原因(1)两个供试棉花品系库源比不同。自蕾期开始,E系库源比一直高于L系,且中后期差异更大。其中,在播种后110和125 d,E系库源比分别比L系高 61.5%和 21.6%。(2)两个棉花品系叶片衰老快慢差异显著。虽然两品系主茎功能叶叶绿素含量都是先升高后降低,但两者之间差异显著。在播种后110和125 d,E系叶片叶绿素含量比L系分别低23.5%和19.2%,光合速率(Pn)分别低29.3%和29.9%,丙二醛(MDA)含量则分别高42.4%和51.0%。在播种后95、110和125 d,E系叶片脱落酸(ABA)含量比L系分别高11.9%、10.9%和7.8%;细胞分裂素类物质(CTKs)含量则分别低10.5%、10.3%和8.2%。(3)两个棉花品系叶片衰老的差异与一系列相关基因差异表达有关。在播种后88和106 d进行两个棉花品系叶片表达谱测定。结果表明,两个棉花品系叶片衰老过程中差异表达基因主要富集在光合作用、大分子代谢和植物激素信号转导途径等。两个棉花品系叶片衰老过程中发现大量差异表达的转录因子基因,其中包括34个WRKY和28个NAC转录因子基因。随着棉花叶片逐渐衰老,有32个WRKY和23个NAC转录因子基因在E系和L系中均上调表达,说明WRKY和NAC转录因子可能在棉花叶片衰老中起重要作用。随着棉花叶片进一步衰老,大部分脱落酸、茉莉酸、水杨酸和赤霉素信号转导途径相关基因上调表达,而大部分细胞分裂素、油菜素内脂和生长素相关基因下调表达。实时荧光定量PCR结果表明,随着棉花叶片衰老,主茎功能叶中ABA降解基因(CYPA707A)逐渐降低,但ABA合成基因(NCED)表达量逐渐升高,说明ABA可能参与促进棉花衰老。(4)GhYL8基因调控棉花叶片衰老。表达谱鉴定到3个衰老上调表达的ABA受体基因(GhPYL),但这3个PYL基因在E系中的表达量均低于L系,暗示这3个PYL基因可能与两品系衰老差异有关。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)分别在两品系中分别沉默了其中PYL8基因(GhPYL8),发现黑暗处理下,GhPYL8基因沉默棉苗叶片叶绿素含量增加,MDA含量降低,延缓了暗处理下的叶片衰老,说明GhPYL8基因参与调控棉花衰老。GhPYL8基因克隆发现该基因在两个品系间存在3个位点的碱基差异。进一步分析发现,只有L系GhPYL8基因的第223位碱基突变导致产生了氨基酸的改变,深入研究L系GhPYL8基因突变对棉花衰老的调控作用,有助于揭示两品系间衰老差异的机制。2.去早果枝降低了库源比并延缓了棉花叶片早衰(1)去早果枝降低了两个棉花品系的库源比。两年试验结果皆表明,去早果枝显著降低了两个棉花品系的库源比。其中,在去早果枝后50和65 d,L系去2个早果枝(LR2)的库源比较未去早果枝的对照(LR0)降低了 10.1%和17.4%,去4个早果枝(LR4)降低了 53.7%和34.8%;E系去2个早果枝(ER2)的库源比较未去早果枝的对照(ERO)降低了 42.4%和5.7%,去4个早果枝(ER4)降低了 80.1%和 16.4%。(2)去早果枝显著延缓了两个棉花品系主茎功能叶的衰老。在去早果枝后65 d,LR2处理的叶片叶绿素含量和光合速率分别比LRO提高了 8.5%和11.6%,丙二醛(MDA)含量则降低了 7.8%;LR4的叶片叶绿素含量和光合速率分别提高了 10.5%和19.6%,MDA含量则降低了 14%。ER2处理的叶片叶绿素含量和光合速率分别比ERO提高了 5.8%和12.1%,MDA含量则降低了 7.9%;ER4处理的叶片叶绿素含量和光合速率分别提高了 19.8%和25.1%,MDA含量降低了18.4%。在去早果枝后50和65 d,LR2处理的叶片ABA含量分别比LRO降低了 7.2%和10.1%,LR4叶片ABA含量分别降低了 13.7%和15.6%。ER2处理叶片ABA含量分别比ERO降低了 15.9%和13.3%,ER4叶片ABA含量分别降低了 25.1%和31.5%。在去早果枝后50和65 d,LR2处理的叶片iP+iPA含量分别比LRO提高了 7.4%和12.9%,LR4叶片iP+iPA含量分别提高了 10.4%和16.3%。ER2处理的叶片iP+iPA含量分别比ERO提高了 8.5%和12.1%,ER4叶片iP+iPA含量分别提高了 13.2%和11.1%。在去早果枝后50和65 d,LR2处理的叶片JA含量分别比LRO降低了 6.8%和9.1%,LR4叶片JA含量分别降低了 12.1%和13.5%。ER2处理叶片的JA含量分别比ERO降低了 13.7%和11.7%,ER4叶片JA含量分别降低了 20%和24%。(3)去早果枝延缓叶片衰老是衰老相关基因的差异表达所致。去早果枝后5～65 d,LR2和LR4主茎功能叶中叶绿素合成蛋白基因GhLHCB表达量分别上调1.18～1.65和1.21～2.35倍;ER2和ER4主茎功能叶中GhLHCB表达量分别上调1.15～9.4倍和1.21～10.7倍。在去早果枝后65 d,LR2主茎功能叶中ABA合成关键基因NCED2、NCED5和NCED9表达量分别下调39%、17%和69%,LR4中分别下调75%、87%和95%;ER2主茎功能叶中ABA合成关键基因分别下调95%、8%和74%,ER4分别下调75%、36%和63%。在去早果枝后50 d,LR2主茎功能叶中CYP70741、CYP707A2和CYP707A4的表达量分别上调1.2,1.2和4.1倍,LR4主茎功能叶中分别上调1.3,2.0和9.1倍;ER2主茎功能叶中CYP707A1、CYP707A2和CYP707A4的表达量分别上调3.5、1.6和1.1倍,ER4主茎功能叶中分别上调了 2.8、16.6和1.5倍。在去早果枝后50 d,LR2主茎功能叶中JA合成关键基因LOX、AOS和AOC表达量分别下调57%、78%和98%,LR4中分别下调78%、91%和98%;ER2主茎功能叶中JA合成关键基因LOX、AOS和AOC表达量分别下调56%、26%和27%,LR4中分别下调76%、42%和67%。在去早果枝后35和65 d,与未去早果枝对照相比,去早果枝后LOX、AOS和AOC表达量同样都是下调表达。(4)去早果枝对棉花产量的影响因基因型和所去果枝数而异。2015年和2016年,LR2的籽棉产量分别比未去早果枝的对照降低8.7%和6.4%,LR4降低了 15%和12%;而ER2的籽棉产量分别比未去早果枝的对照增加10.2%和6.3%,ER4 降低了 5.7%和 11.7%。2015年和2016年,LR2的铃重分别比LR0增加了 6.8%和11.9%,铃数降低了降低14.5%和16.2%;LR4铃重增加了 3%和11.1%,铃数降低了 15.9%和20.6%。ER2的铃重分别比未去早果枝的对照增加14.9%和8.9%,铃数降低了4.1%和2.3%;ER4铃重增加了 22.7%和8%,铃数降低了 31.7%和11.7%。LR2和LR4的收获指数比LR0分别降低了 7.2%和11.2%;ER2的收获指数与LR0相当,ER4收获指数降低了 9.8%。LR2和LR4首次花比重比未去早果枝的对照分别降低了 17.9%和47%;ER2的首次花比重与对照相当,ER4则降低了37.9%。综上所述,两个棉花品系的库源比以及中后期主茎功能叶叶绿素含量、光合速率和叶片MDA含量存在显著差异,表明两个棉花品系叶片衰老快慢不同,叶片衰老的差异与库源比不同有关。表达谱数据分析表明,不论衰老慢还是衰老快的棉花品系,衰老均导致叶绿素降解,光合作用相关基因下调表达,同化能力下降;而大分子代谢能力增强,异化能力增强。两个品系棉花衰老过程中大量激素相关基因发生差异表达,其中包括大量ABA信号转导相关基因。沉默GhPYL8基因延缓暗处理下棉苗衰老,说明GhPYL8基因正调控棉花衰老。两品系间GhPYL8基因的表达差异和L系GhPYL8基因的突变可能与两品系间衰老差异有关。去早果枝降低了两个棉花品系的库源比,中后期主茎功能叶叶绿素含量、光合速率显著提高、叶片MDA含量则显著降低,进一步证实降低库源比显著延缓棉花衰老。去早果枝触发棉株内叶绿素合成蛋白基因GhLHCB、ABA合成关键基因和JA合成关键基因等衰老相关基因的差异表达,内源激素ABA和JA降低、iP+iPA含量增加,叶片叶绿素含量和光合速率提高,MDA含量降低,从而延缓了叶片衰老。E系去2个早果枝通过延缓叶片衰老获得正常熟相,籽棉产量增加8.3%,E系去4个早果枝和L系去2或4个早果枝皆导致晚熟,显著减产,说明通过去除早果枝改变库源比虽然是调节棉花库源关系和抑制叶片衰老的有效手段,但叶片衰老延缓并不意味着一定增产,只有库源比恰当、库源关系协调,实现正常熟相才能增产。