论文部分内容阅读
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由赖氨酸单体的α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的聚合物。具有水溶性及生物相容性好、无毒且抑菌谱广等特点,可应用于食品、医药等领域。目前微生物发酵是ε-PL工业化生产的主要方式,产物浓度低、成本高是症结所在。利用基因组重排(Genome shuffling,GS)的方法尝试ε-PL生产菌种的改良已初见成效,但其相关机制尚不明确。因此本研究试图对GS菌株高产机制进行分析,从而为进一步提高ε-PL的产量奠定基础。本文以亲本菌株Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15以及利用GS方法获得的ε-PL高产菌株Streptomyces sp.AF3-44为对象,考察了pH和ε-PL耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系,并在此基础上通过外源添加效应物进一步提高AF3-44合成ε-PL的能力。主要内容与结果如下:比较了GS菌株AF3-44与其亲本菌株F15和AS32在pH和ε-PL耐受性、氧化损伤和菌体活力方面的差异,结果表明:AF3-44具有较高的pH和ε-PL耐受能力以及抗氧化损伤能力,导致了该菌在发酵过程中的菌体活力和ε-PL发酵水平高于其亲本菌株。对AF3-44与其亲本菌株F15和AS32发酵过程中的海藻糖含量、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)活力变化进行了分析,结果发现AF3-44在整个发酵过程中海藻糖含量始终高于其亲本菌株;GS菌株发酵前期SOD和CAT酶活力高于两亲本,而发酵后期CAT和G6PDH酶活力高于两亲本。以上结果表明高海藻糖含量及高酶活力使得AF3-44对酸性pH和高浓度ε-PL有较高的耐受性。考察了发酵过程中氧化胁迫的诱因以及效应物对ε-PL发酵的影响,发现pH、ε-PL均能诱发菌体产生氧化胁迫作用,ε-PL诱导活性氧(ROS)产生主要发生在发酵前期,而pH主要在发酵后期起作用。ε-PL摇瓶自然发酵过程中抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的添加显著提升了ε-PL的产量。研究了GSH在ε-PL发酵以及ε-PL合成途径关键酶表达中的作用,结果表明:在5L发酵罐中,采用于pH 6.5时连续流加GSH的策略,分批发酵ε-PL产量为10.50 g·L-1,与对照组(不添加GSH)相比提高了68.8%。补料分批发酵的ε-PL产量为46.54 g·L-1,与对照组相比提高了17.8%。通过qRT-PCR分析,发现GSH提高了ε-PL合成途径中磷酸果糖激酶、柠檬酸合酶、天冬氨酸激酶、ε-聚赖氨酸合成酶基因的转录水平进而增加了ε-PL产量。