1研究背景抑郁症是一种慢性精神类的疾病,以显著而持久的心情低落为主要临床特征,主要表现为情绪低落、自卑抑郁、思维迟钝、悲观厌世等,严重者甚至有自杀倾向,并具有高患病率、高疾病负担率、高复发率、高致残率、高自杀率等特点。而与之对应的肝郁脾虚证为中医临床常见的证候。现代医学主张“辨病论治”主张从疾病的全过程认识疾病;而传统医学主张“辨证论治”从疾病的当前的表现去判断疾病的病变部位与性质,抓住当前的主要矛盾。由于“辨病论治”或者“辨证论治”所反映的侧重点不同,所以本文采取病症结合的思路,从“宏观”与“微观”的角度对抑郁症肝郁脾虚证进行相关的探索。星形胶质细胞(Ast)是中枢神经系统中数量最多,分布最为广泛的一类细胞。近年来随着对Ast功能研究的不断深入,发现其在神经精神类疾病的发生和发展中起着越来越重要的作用。目前对Ast的研究,已经成为抑郁症病理生理机制研究的一个热点,而且对星形胶质细胞的调控有望成为防治抑郁症的重要靶点。另外,一些研究还发现在一些年轻的早发性抑郁症患者的脑内Ast的数目和其特异性细胞骨架蛋白—GFAP表达量显著性降低,而GFAP的表达水平能随着年龄的增加而增高,因而在年龄较大的患者脑内与其年龄相匹配的正常对照组相比并没有观察到这种显著性的变化。这一结果似乎提示我们在早发性抑郁症和迟发性抑郁症患者的大脑中,GFAP参与抑郁症的发病机制是不同,甚至是截然相反的。谷氨酸是哺乳动物脑内最重要的一类兴奋性神经递质,由葡萄糖经三羧酸循环的产物α-酮戊二酸转化而来,也可由谷氨酰胺水解生成。Glu在中枢神经系统分布不均,以大脑皮质、海马、小脑和纹状体含量最高,脑干和下丘脑次之,脊髓最少。γ氨基丁酸是脑内最重要的一类抑制性神经递质,由L-谷氨酸脱羧生成,在脑内含量也非常丰富,GABA能神经元主要分布于大脑皮质与小脑皮质、纹状体、海马等区域。这些脑区与情感、精神活动密切相关。对单相抑郁症患者和躁郁症病人的磁共振成像(MRI)研究和死后患者的病理学报告中发现谷氨酸能环路出现异常。逍遥散是中医用于治疗肝郁脾虚证的经典名方,已经被广泛地运用到肝郁脾虚证的临床与实验研究当中。实验室所在的课题组长期从事抑郁症肝郁脾虚证的动物实验研究,先后建立了慢性束缚与CUMS的抑郁大鼠模型,发现经典名方逍遥散对其有较为显著的调节作用,逍遥散可以干预多种神经环路,具有多靶点,多导向的作用。但是是否通过调节对GFAP与NMDA起到调节作用,目前机制尚不明确。有学者提出当大脑发生应激反应时可能会损坏HPA-Glu-NMDA受体-NO途径,Glu是大脑中最重要的一类兴奋性神经递质,对于学习、记忆和情绪都有很强的关联性。当机体发生应激反应时HPA轴激活,导致Glu合成、分泌增加,在一定程度上提高了大脑的兴奋性,使机体适应应激与刺激的能力增加,导致GC升高,机体的适应能力与敏感性增强,这种行为被称为“非稳态负荷”,但同时会造成海马的神经毒性,随着刺激的进一步持续,最终引起海马神经细胞的坏死。因此本文提出了这样的假设:慢性应激→HPA轴功能亢进→皮质酮含量增高→Glu系统适度激活→机体适应能力增强-→Glu系统过度激活→海马神经元损伤→GFAP含量下降→抑郁症。2研究目的本实验首先通过CUMS即慢性不可预知温和应激的方法复制抑郁症肝郁脾虚的大鼠动物模型,首先通过行为学以及CORT的变化确认模型是否复制成功,然后通过实时荧光定量PCR与WB等实验进一步探讨海马GFAP与NMDA的2型受体的变化情况,并观察逍遥散对其“宏观”包括行为学、进食量与体重的变化情况与“微观”指标的变化。3研究方法本课题由四部分组成一:通过对古代文献关于抑郁症方面的文献进行梳理,初步从理论层面对抑郁症的病因病机,发病机制,理法方药进行一定的梳理,以期为实验的研究提供相应的理论依据与支撑。二:实验一结合课题组前期工作的的经验与认识,以CUMS即慢性不可预知温和应激的方法复制抑郁症肝郁脾虚的大鼠动物模型。观察大鼠的一般身体状况体重、进食量、旷场及糖水实验的行为学变化、用Elisa检测血清中皮质酮(CORT)的变化。并运用中医经典名方逍遥散与西医治疗抑郁症的一线临床用药氟西汀对CUMS大鼠进行干预。三:实验二运用实时荧光定量聚合酶链反应即(RT-qPCR)技术检测大鼠海马部分的GFAP与NMDA2B的表达情况,同时观察逍遥散与氟西汀的调节作用。从基因方面对其进行一定的探索。四:实验三用免疫印迹法(WB)的方法检测大鼠海马GFAP与NMDA2B在蛋白层面的表达情况。并结合逍遥散与氟西汀对其的干预情况进行进一步的总结与讨论。4研究结果实验一:首先成功复制了 CUMS慢性不可预知温和应激的大鼠模型,大鼠在应激状态下逐渐出现摄食量的降低和体重增加减慢的表现,大鼠出现毛发变得枯黄、身体倦怠活动减少、大便干湿不调等身体外观体征状态方面的变化;行为学研究显示:在旷场实验中大鼠移动总距离和中央区停留时间逐渐降低,糖水试验中糖水偏好率降低;微观指标检测显示:血清CORT水平升高。而逍遥散组和氟西汀组则相对于模型组大鼠的各项指标有着比较明显的改善。实验二:在实验一成功复制模型的基础上,运用RT-qPCR的方法进行“微观”指标基因层面的检测,实验结果显示,正常组大鼠、模型组与给药组大鼠之间GFAP与NMDA2B的mRNA均出现了较为显著的差异,在指标NR2B的检测中,模型组相对于正常组出现了NR2B的减少,但是二者还没有统计学的差异,逍遥散组相对于模型组出现了显著增高,而且两者之间有较为显著的统计学差异(P<0.01).氟西汀组相对于模型组也出现了显著性的增高,二者之间的统计学差异较为显著(P<0.01)。在指标GFAP的检测中,模型组相对于正常组出现了显著性增高的趋势,而且逍遥散组对于模型组出现了显著增高,而且两者之间有较为显著的统计学差异(P<0.01).氟西汀组相对于模型组也出现了显著性的增高,二者之间的统计学差异较为显著(P<0.01)。实验三:在实验一的基础上取材后运用WB的方法进行蛋白层面的检测,在(GFAP的检测中,模型组对比正常组出现了显著降低,而且二者之间有统计学差异(P<0.01),逍遥散组与模型组对比,也出现了显著性的增高,二者之间有统计学差异(P<0.05),氟西汀组与模型组对比,也出现了显著性的增高,二者之间有统计学差异(P<0.05)。在NMD2B的检测中模型组对比正常组出现了显著降低,而且二者之间有统计学差异(P<0.05),逍遥散组与模型组对比,也出现了显著性的增高,二者之间有统计学差异(P<0.01),氟西汀组与模型组对比,也出现了显著性的增高,二者之间有统计学差异(P<0.01)。5实验结论理论探讨方面对历代抑郁症方面的古籍资料进行了较为细致的论述与整理,发现抑郁症中肝郁脾虚证为最为常见的证型,但是诸如肝阳气虚与肾阳虚在抑郁症的中、重度阶段也同样不可忽视。实验一中行为学与宏观体征的表现都说明了本实验成功地复制了 CUMS慢性不可预知温和应激肝郁脾虚证大鼠模型,此模型的大鼠出现了类似于中医肝郁脾虚证的情绪抑郁(抑郁样行为)、闷闷不乐,脘腹胀满、食少便溏(体重增长减缓和进食量降低)、(大便溏结识不调)等变化,而运用中药复方逍遥散与治疗抑郁症的经典西药盐酸氟西汀干预后各指标的逆转也从侧面验证了模型的成功建立。实验二的实时荧光定量PCR的检测中,在基因层面模型组NR2B的表达显著降低,模型组分别和逍遥散与氟西汀组对比结果均显示有显著性差异(P<0.01),表明抑郁症肝郁脾虚证大鼠在CUMS慢性应激的刺激下出现了 NR2B的表达下调,但是在中药复方逍遥散与西药氟西汀的作用下在一定程度上改善了 NR2B的表达情况。在基因层面模型组的GFAP与中药组与西药组有显著性差异(P<0.05),表明逍遥散与氟西汀能在一定程度上改善由于慢性应激造成的星形胶质细胞与GFAP的损伤。实验三westernblot的结果显示:和正常组相比,模型组的海马组织NR2B的蛋白表达均下降,经逍遥散与氟西汀治疗后,NR2B的蛋白含量均出现了不同程度的升高(P<0.05),而且差异具有统计学意义。表明逍遥散与氟西汀能够升高由于慢性应激导致的NR2B的表达下调。GFAP的表达在模型组出现了显著降低,经逍遥散与氟西汀治疗后,出现了较为明显的升高,也各组与模型组相比均具有统计学意义(P<0.05),说明了逍遥散与氟西汀能够改善GFAP在大鼠海马的表达。以上这些实验正好证实了实验开始前的一个假说,CUMS慢性应激导致模型组大鼠HPA轴的终末产物CORT的增高,继而导致Glu系统的适度激活,机体适应能力增强,然而随着应激的进一步持续,海马神经元损伤,星形胶质细胞GFAP减少,最终导致抑郁症的发生。逍遥散与氟西汀都是临床上治疗抑郁症肝郁脾虚证的常见用药,通过实验可以看出逍遥散与氟西汀能显著提高GFAP与NR2B基因与蛋白在“微观”层面的表达,在逍遥散与氟西汀的药物干预下,大鼠在宏观表征与行为学等方面也出现了一定的改善。