云杉属(Picea)植物是寒温带地区最具代表性的森林建群种树种,全世界自然种约42种14变种。我国目前有16种9变种,是亚高山林区的主要组成树种。四川地区云杉植物丰富,有11种2变种。四川西部亚高山针叶林是长江上游重要的生态屏障。上世纪60年代,云杉作为主要造林更新树种在四川西部形成了大量人工纯林。上世纪90年代末,在四川西部的26.67万hm2人工云杉幼林中,有近3.33万hm2发病,并呈逐年蔓延的趋势。近年来,在四川亚高山人工云杉林区,云杉植物生长缓慢或停滞,落针病发生较为严重,落针病发生面积达3.94万hm2。查阅文献发现在现有报道中,造成云杉落针主要有云杉落针病、云杉叶疫病和云杉叶锈病3种病害。目前,国内针对云杉落针病害的研究主要集中在病害的防治技术方面,关于落针病害病原菌的系统研究仍缺乏详实资料。本文对川西地区人工云杉林的重要分布区域进行设点调查与系统研究,样地囊括了甘孜州泸定县二郎山林区与马厂梁林区、绵阳市平武县洋洞河林区、雅安市宝兴县神木垒林区与天全县白沙河林区以及阿坝州松潘县小姓林场与九寨沟县风景区林区等13个人工云杉林分布区,对川西地区人工云杉林中的3种落针病害进行了系统研究。通过传统真菌分离法,对云杉针叶内生真菌群落结构进行界定,同时分析人工云杉林病原菌或潜在病原菌的种类和生态地位;借助光学显微镜和扫描电子显微镜等技术对病原菌各形态特征加以描述,并辅以多基因序列分析对病原菌的系统发育和分类地位进行综合分析。本文获得的重要成果如下:1.云杉落针病(Lophodermium piceae)、云杉叶疫病(Rhizosphaera kalkhoffii)和云杉叶锈病(Chrysomyxa spp.)在川西地区人工云杉林均有发生。通过分离鉴定,从云杉针叶上分离得到内生真菌共计37属61种。其中,平武县洋洞河林区分离得到16属20种,优势菌株(分离频率>50%)为Aspergillus fumigates、Rhizosphaera kalkhoffii和 Cladosporium cladosporioides;马厂梁林区分离得到 9 属 12 种,Thielavia microspora、Phoma sp.、R.kalkhoffii和 C.cladosporioides 是针叶上的优势种;二郎山林区5属5种,R.kalkhoffii为优势种;天全白沙河林区14属21种,优势菌为Schizophyllum commune、Stagonosporopsis cucurbitacearum Aspergillus fumigates 3 种;松潘小姓林场的健康云杉上,青霉属真菌(Penicillium)种类多,数量大,占有明显的组成优势。云杉叶疫病菌R.kalkhofffii作为优势菌株在多个林区均有发生。另外,从内生真菌中发现5种潜在病原菌,Sydowia polyspora、Phoma sp.、Phomopsis sp.、Mycosphaerella sp.、Schizophyllum commune。2.云杉叶疫病菌R.kalkhoffii在四川洋洞河林区、二郎山林区和马厂梁林区均存在。首先,R.kalkhoffii在春季易以内生真菌形式被分离得到,在2年生针叶上的分离频率可达58.82%,在1年生针叶上的分离频率可达85.52%。其次,在洋洞河和二郎山林区的落地针叶子囊果分离过程中也意外地被分离得到。由此可见,R.kalkhoffii在云杉植物活体针叶和凋落针叶有分布。通过室内培养观察,该菌在人工培养条件下产生两种类型的分生孢子,小分生孢子5.3～10 μm×3.3～5.8 μm,大分生孢子11.2～19.0μm×5.0～8.5μm,有1-3个隔,萌发管从大孢子两端伸出,也可从分隔处伸出萌发。据文献报道,该菌在枯死针叶上产生子实体越冬后侵染新生针叶,目前在川西地区云杉针叶上并未发现子实体的生成,病原菌主要以菌丝的形式在针叶中存活并进行传播。3.云杉散斑壳L.pice e的形态和ITS-rDNA具有多变性。与欧洲云杉上L.piceae以及云杉上L.nanakii描述一致的是子囊果中度隆起,均无唇细胞,但比较发现,川西地区测得的L.picea 子囊果、子囊及子囊孢子测量值均比L.nanaki 和挪威云杉上的L.piceae更大。此外,四川各地云杉散斑壳的子囊果、子囊、子囊孢子大小之间有差异或者显著差异。通过ITS-rDNA序列在NCBI中比对,结果显示川西地区云杉散斑壳与基因库中来自欧洲云杉上的L.piceae具有较高的相似度。同时,从系统发育树可以看出,相同地理来源的L.picea 的ITS-rDNA具有多变性,它们之间遗传差异与地理位置没有关系。另外,Barklund认为欧洲云杉上L.piceae和L.nanaki 是同种,但NCBI中因没有收录L.nanaki 的基因序列,无法进行序列分析。4.川西地区人工云杉林落针病害增添一新病原为小沟盘菌属一新种(Lirula sp.nov.),该菌寄生于川西云杉Picea batforiana针叶上,可致使云杉2年生死亡,由此引发的叶枯病新病害亦为首次报道。小沟盘菌属(Lirula)分布在北美、欧洲和亚洲,目前该属包括11种1变种,其中3种发生在云杉属植物(Picea)上。该新种主要发生在2年生云杉针叶上,4月底子囊果和分生孢子器开始成熟释放孢子,此时当年生针叶未萌发,子囊孢子主要侵染1年生针叶,受侵染后的针叶逐渐枯死,极少脱落,待翌年初春在针叶上生成新的子囊果。通过子囊果切片观察,显示该新种在形态特征上与云杉上的同属真菌L.brevispora、L.macrospora和L.fliiformis均有较大的差异;ITS rDNA序列比对结果与L.macrospora的相似度达96%,但与该菌的亲缘关系较远。此外,该新种在云杉上有较强的寄生性和致病性,有扩散蔓延的趋势,应加强监测与防控。5.川西地区云杉叶锈病病原菌包括5种金锈菌属(Chrysomyxa)真菌。通过显微制片观察,发现在4个林区共有5种金锈菌,其中包括一种短世型金锈菌寄生在云杉2年生针叶上。根据锈孢子表面物将疣分3种类型:刺型、钉头型、疣突型。二郎山丽江云杉P.likiangensis和马厂梁林芝云杉P.likiangensis var.linzhensis的金锈菌锈孢子表面形态一致,其疣均为刺型且锈孢子大小接近,ITS序列blastn比对结果显示一致性达100%,为同种金锈菌。其他林区的3种叶锈病菌锈孢子的疣有疣突型或钉头型,基部由纤丝组成底座,但疣的形状和长度,以及孢子的大小等形态特征之间有明显差异,从形态特征上显示为不同的3种金锈菌。与国外报道的形态特征相比,川西地区病原菌锈孢子表面均无凹槽或者纵向的“帽”结构。金锈菌(Chrysomyxa)多为转主寄生型,是云杉叶锈病、芽锈病和球果锈病的病原菌。该属菌可转主寄生在杜鹃亚科(Rhododendroideae)、岩高兰科(Empetraceae)、鹿蹄草亚科(Pyroloideae)和越桔亚科(Vaccinioideae)。调查发现林下杜鹃叶背面冬孢子堆有垫状和头状突起两种类型,其中头状突起冬孢子堆为亚洲特有类型。采用ITS和28SrDNA序列分析显示,二郎山林区、马厂梁林区、神木垒林区的云杉叶锈病和林下杜鹃锈病的亲缘关系近,说明转主寄主的可能性极高;此外,在马厂梁林区、神木垒林区以及洋洞河林区,杜鹃头状冬孢子堆基因序列分别聚类在不同的分类单元,亲缘关系远,进一步说明了 3个林区是不同的金锈菌。当前,将冬孢子和锈孢子的基因序列进行系统发育分析,结合形态特征探讨它们之间的亲缘关系,将有助于完善金锈菌的生活史。6.金锈菌多基因扩增并测序显示核糖体基因ITS、LSU和SSU比线粒体基因(CO1、C03、NAD6、ATP6)有更稳定的扩增结果。本文主要采用28S rDNA序列构建云杉和杜鹃植物上金锈菌的系统发育树,可以很好的将金锈菌与其他锈菌区分开来。将杜鹃上冬孢子堆和云杉针叶上的锈孢子基因序列进行blastn比对,发现ITS rDNA序列间的差异性大于28S rDNA序列,这可能与核糖体大亚基具有更高的保守性有关;系统发育分析时发现,当扩大数据,采用ITS rDNA序列构建系统发育树,金锈菌属容易与其他属锈菌聚类在一起,如 Cronatium sp.、Coleosporium sp.、Melampsoridium sp.。由于SSU序列较保守,测序结果显示金锈菌与多属锈菌的相似度极高,均可达99%～100%,故不能将不同属锈菌进行系统发育聚类。