人内皮细胞特异性分子-1真核表达及在肿瘤中表达的初步研究

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目的 探讨人内皮细胞特异性分子-1(human endothielial cell specific molecule-1,hESM-1)在某些肿瘤组织表达情况及肾癌组织中的表达和意义;构建hESM-1真核表达载体,转染和表达。方法 以饱和硫酸铵法和CM-sepharoseFF阳离子交换层析纯化的鼠抗hESM-1 IgG;以纯化的鼠抗hESM-1IgG为一抗,建立Western Blot方法,检测八种肿瘤组织中hESM-1的表达,用原位杂交、SP免疫组织化学方法检测肾癌组织和正常肾组织中hESM-1蛋白的表达。扩增重组质粒pET28b-hESM-1,提取质粒并进行酶切、纯化hESM-1 cDNA片段,将目的基因插入pIRES中构建真核表达载体,转化入大肠杆菌XL1-blue,由蓝白选择、耐药性标记两种方法挑取阳性克隆,并由限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法进行鉴定。重组质粒pIRES-hESM-1经脂质体法转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,原位杂交和免疫组化检测hESM-1基因的转录和蛋白水平表达。结果 纯化的抗hESM-1的单克隆抗体纯度为95%,浓度为1.24mg/ml,筛选hESM-1在肾癌和肝癌组织中有表达,免疫组织化学显示hESM-1主要定位于血管内皮,且肾癌标本中hESM-1阳性表达显著高于正常肾组织。构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实,转染后发现hESM-1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加。结论 纯化获得高浓度、高纯度的抗hESM-1的单克隆抗体,hESM-1在受检的部分肿瘤组织(肝癌、肾癌)中有表达,肾癌中表达的增加可能与其发生发展有关,hESM-1可能为反映。肾癌生物学行为的指标之一。成功构建了hESM-1真核表达载体、转染了ECV304并获得表达,为进一步研究打下良好的基础。
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