肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)作为一种重要的条件性致病菌,能够引起人类及猪、牛、羊、兔和其他经济类动物的感染,可导致呼吸系统、泌尿系统、泌乳系统炎症和创伤感染,严重时甚至引起败血症、脑膜炎和胸膜炎。近年来由于抗生素的滥用,已经导致该细菌耐药性的大幅增强。迄今为止,国内外对于肺炎克雷伯菌在规模化猪场中流行情况以及检测方法的报道少之又少。本文通过采集吉林省部分规模化养猪场疑似感染肺炎克雷伯菌的病料,并对分离获得的细菌进行形态学、生化试验、16S rDNA分子生物学鉴定,对筛选出的肺炎克雷伯菌,进一步进行耐药性、致病性、毒力基因检测和荚膜型鉴定。并通过三种不同方法制备肺炎克雷伯菌抗原,建立肺炎克雷伯菌间接ELISA检测方法,最后对吉林省部分规模化猪场肺炎克雷伯菌血清抗体流行情况进行调查,以期对吉林省猪群养殖过程中对于该菌早期感染的诊断及防控提供一定的理论支持。1.猪源肺炎克雷伯菌的分离鉴定从吉林省部分规模化猪场,采集疑似感染肺炎克雷伯菌的病料。通过形态学、生化试验、16S rDNA分子生物学鉴定,共分离获得14株肺炎克雷伯菌。通过对其进行抗生素耐药性检测,结果显示:大部分菌株对β-内酰胺类药物、氨基糖苷类药物、四环素类药物呈现较强的耐药性。通过对其进行致病性及致病基因的检测,结果显示14株分离株,均携带Khe基因(100%),7株携带ramp基因(50%),wacG基因检出率为0%。荚膜分型结果显示:14株肺炎克雷伯菌中12株为荚膜型K 20型(85.71%),2株为K 1型(14.29%)。其中毒力最强株(编号为2)荚膜型为K 20型。2.间接ELISA方法的建立选择毒力最强的2号菌株进行抗原的制备。采用三种不同抗原制备方法,通过方阵滴定试验,确定抗原和血清的最佳浓度,随后对血清作用时间、酶标抗体稀释倍数和作用时间及底物作用时间进行优化,并确定其临界值,最后进行ELISA方法敏感性、特异性和稳定性的检测。结果显示:以耐热抗原建立的ELISA方法蛋白浓度为14.820 mg/mL,抗原最佳稀释倍数为160倍、血清作用1.5 h、酶标抗体稀释倍数为500倍且作用时间为1 h、酶标抗体稀释倍数为500倍且作用时间为1 h时反应条件为最佳。通过公式计算其临界值为0.610。且该方法敏感性、特异性和稳定性良好,可以进行肺炎克雷伯菌血清抗体的检测。3.吉林省部分规模化猪场肺炎克雷伯菌血清流行病学调查基于前期建立的肺炎克雷伯菌间接ELISA检测方法,对采集到的558份血清样本进行检测。结果显示:肺炎克雷伯菌在吉林省规模化猪场中血清抗体阳性率较高,总阳性率为30.46%(170/558)。从样品采集地点来看,长春市规模化猪场阳性率最高,阳性率为8.60%(48/558);其次为延吉市,阳性率为6.09%(34/558),公主岭市最低,阳性率为1.61%(9/558);从采集样品所处年龄阶段来看,初生仔猪和经产母猪肺炎克雷伯菌抗体血清阳性率最高,阳性率分别为12.19%(68/558)和14.70%(82/558);而育肥猪和后备母猪阳性率较低,阳性率分别为1.97%(11/558)和1.61%(9/558)。