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甘蓝型油菜既是重要的食用油来源,也是重要的化工原料,而决定其用于食用还是作为工业原料的一个重要指标就是菜籽中的芥酸含量,食用油要求低芥酸的含量,而工业用则需要高芥酸含量,因此了解芥酸代谢过程,调控芥酸含量对于甘蓝型油菜育种具有非常重要的意义。以往对于芥酸的代谢途径以及调控主要针对靶标基因的反义抑制、RNAi和过表达,而对于芥酸代谢相关的微小RNA（miRNA）以及对芥酸含量的调控却鲜有研究。为此,本研究采用生物信息学以及sRNA和降解组高通量测序对芥酸代谢相关的miRNA及其靶基因进行分离,通过对靶基因功能分析,明确了miRNA在芥酸代谢中的作用。针对芥酸合成过程中的关键酶基因设计特异amiRNA,构建种子特异表达载体,研究amiRNA对芥酸和脂肪酸代谢的调控,取得如下结果:1.本研究以甘蓝型油菜芥酸代谢过程中关键基因为靶基因,通过生物信息学分析其对应的靶miRNA,经过分析、筛选,从而分离出以芥酸代谢基因为靶基因的保守miRNA序列,并利用q-PCR技术对分离的miRNA进行鉴定。我们发现miR156、miR161、miR840、miR2923、miR5380、miR1044、miR7504、miR5079、miR6116、miR5143、miR9563,它们能够以Brassica napus 3-ketoacyl-CoA synthase（KCS）、Brassica napus 3-ketoacyl-CoA thiolase（KAT）、Brassica napus acyl-[acyl-carrier-protein]desaturase、Brassica napus acyl-coenzyme A oxidase 4、Brassica napus omega-6 fatty acid desaturase（FAD2）家族的一个或多个基因为靶基因,而这些靶基因在脂肪酸碳链的延长、脂肪酸的去饱和β氧化等过程中发挥着重要作用,而miRNA能够通过对这些靶基因的调控参与到甘蓝型油菜芥酸代谢过程,并在此过程中起着非常重要的作用。2.利用高通量测序对不同发育时期的高芥酸甘蓝型油菜种子进行miRNA测序,对miRNA测序数据进行分析共得到936个mi RNA序列,其中保守miRNA序列151个,新保守miRNA序列246个,新miRNA序列539个。对所有识别的miRNA序列利用TargetFinder软件进行靶基因的预测,得到靶基因序列20354条,对预测的靶基因利用KOG、GO、KEGG数据库进行基因功能注释。将不同时期的样品提取RNA后进行等量混样,利用混合后的样品进行降解组测序,降解组测序得到的转录本与miRNA测序数据及其预测的靶基因进行联合分析,共发现236个miRNA的589个靶基因。通过对匹配的靶基因功能进行分析发现,miR838、mi R156e、miR159c、bna-5p-16395718、bna-5p-16395718、bna-5p-3961927、miR156a、miR172b、miR395b-p3、miR9563a-p3和miR9563b-p5共11个miRNA;而被这些miRNAs调节的靶基因有long-chain acyl-CoA synthetase,enoyl-CoA hydratase（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase）、stearoyl-Co A desaturase（delta-9 desaturase）acyl-CoA oxidase、pyruvate dehydrogenase phosphatase、dolichyldiphosphatase和choline-phosphate cytidyl transferase等,这些靶基因参与到芥酸代谢过程中碳链的延伸、超长链脂肪酸调节、去饱和、甘油三脂的组装等方面。综上所述,不管是预测的保守miRNA,还是通过测序得到的miRNA序列,它们都能通过调节其靶基因参与到芥酸的代谢过程中,而且其靶基因在芥酸代谢过程中都发挥着重要的作用。因此,所筛选miRNA都能调节芥酸的代谢,并在代谢过程中发挥着重要的作用。3.针对芥酸代谢过程中关键的基因fae1和fad2设计两对特异的amiRNA,并构建种子特异性表达载体pCENNE1和pCENND2,利用农杆菌浸染的方法分别转化高芥酸和低芥酸的甘蓝型油菜,经过草甘膦筛选以及PCR鉴定,获得阳性植株。获得了pCENND2转化的两个油菜品种的T0代种子,并对种子内fad2基因的表达以及种子内的油酸、亚油酸、芥酸的含量进行测定,分析amiRNA对fad2基因的沉默效果以及对芥酸、油酸、亚油酸的调控情况,发现amiRNA能够很好的沉默fad2基因的表达,并且能够一定程度上提高芥酸含量,但是仍然不能达到期望的含量。同时amiRNA对转化株内的油酸起到了很好的调节作用,油酸的积累明显增加,而亚油酸的含量降低的非常显著。综上所述,amiRNA在甘蓝型油菜中可以有效降低fad2基因的表达,但是因为芥酸合成相关酶的限制,虽然无法使芥酸的含量增加的非常显著,但是芥酸的合成底物的积累明显增多,从而为以后多方面协同配合提高芥酸含量奠定了坚实的基础。