阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）、帕金森病（Parkinson’sdisease, PD）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等是严重危害人类健康的一类神经退行性疾病（neurodegenerative diseases，NDD），是由脑中特定区域神经元发生退变而引起的慢性进行性神经系统疾病。近年来，NDD发病率急剧上升，特别是在老龄化人口中。由于其发病机制复杂，因此迄今尚无理想的防治药物问世。导致NDD发生的确切的病理生理学机理尚未明确，目前认为由多种原因引起，并提出了多种假说，其中代表性的有神经递质失衡学说，氧化应激学说、线粒体功能障碍学说、兴奋性神经毒性学说、异常蛋白聚积学说、基因突变、炎症过程、免疫异常及细胞凋亡学说等。近年来越来越多的资料证明，线粒体功能障碍和氧化应激与其他几种机制相互作用，氧化应激和线粒体参与可能是主要的触发因素。细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在各种细胞内不断产生和清除，当体内氧化水平超过了抗氧化作用时，氧化应激就会发生。ROS在细胞信号传导中扮演了重要角色，参与多种生理和病理过程。过氧化氢（H₂O₂）是体内代谢的产物,同时也是一种ROS，在诱导神经元细胞的损伤乃至死亡中起了关键作用。H₂O₂造成的细胞氧化损伤已成为研究神经细胞氧化损伤的重要工具之一。赤芍和土木香均为临床中常用的药物。赤芍为毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根，具有清热凉血、化瘀止痛、消肿通经等功效。土木香是菊科植物土木香Inula helenium L.或藏木香Inula racemosa Hook.f.的干燥根，广泛分布于欧洲中南部和亚洲的喜马拉雅山脉，具有多种药理作用，具有祛痰、止咳等作用，常被用于治疗多种呼吸系统和消化系统疾病。现代药理实验证实，赤芍对神经系统具有保护作用，文献报道赤芍对于PD、AD等NDD的治疗具有一定的作用，但涉及其中的分子机制有待深入系统的研究。ROS在许多疾病包括神经退行性疾病的发生、发展中扮演了重要角色，我们推断具有增加细胞抗氧化能力、具有抑制ROS对细胞损伤的药物可能有助于NDD的防治，所以探讨具有清除ROS和具有神经保护潜能的天然物质对细胞氧化损伤保护作用和机制的研究具有重要意义。赤芍和土木香具有抗氧化作用，体外实验证实赤芍和土木香具有清除DPPH自由基、羟自由基等活性，我们推断赤芍对神经系统的保护作用和赤芍的抗氧化特性有关，赤芍发挥神经保护作用的分子机制可能与清除ROS和阻断细胞凋亡的信号通路有关。目前认为线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路是三个主要的凋亡信号通路，caspase3是这些凋亡信号通路的执行者。关于土木香总黄酮对SH-SY5Y氧化应激损伤的影响未见相关报道。黄酮类化合物是一类次生代谢产物广泛分布在不同植物中，具有各种生物活性如抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎等;也有助于预防心血管疾病和抗血小板聚集。基于以上研究背景，本研究以H₂O₂诱导的神经细胞损伤和凋亡为模型，探讨赤芍相关的三种活性单体芍药苷（paeoniflorin，PF）、没食子酸（gallic acid，GA）和赤芍801（propyl gallate，PG）对H₂O₂引起的人神经母细胞瘤株（SH-SY5Y）细胞损伤和凋亡的影响及其机制。具体内容如下：1H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立目的：建立H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型。方法：不同浓度H₂O₂(12.5、25.0、50.0、100、200、400、800、1600、3200、6400μmol·L^-1)作用SH-SY5Y细胞不同时间（1、2、4、8、12、24小时）诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤，通过相差显微镜观察SH-SY5Y细胞形态变化，利用CCK-8法测定细胞存活率，筛选H₂O₂致SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型的剂量；Heochest33258染色观察凋亡细胞的形态学特征；Annexin V-FITC/PI双染，流式检测细胞凋亡率；碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色流式细胞仪检测细胞周期构成比；硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）催化的INT （2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl-tetrazoliumchloride）显色反应检测乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）释放量，2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate（DCFH-DA）检测细胞内活性氧（ROS）；ELISA （Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay）方法检测8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy deoxyguanosine，8-OHdG）；JC-1染色检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）；Fura-2AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度；利用caspase3可以催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide （Ac-DEVD-pNA）的反应检测caspase3活性；应用caspase9催化特异性底物acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide （Ac-LEHD-pNA）检测caspase9活性。结果：过氧化氢组与正常对照组相比，H₂O₂剂量依赖、时间依赖地造成SH-SY5Y细胞氧化损伤。相对于正常组，终浓度为200μmol L^-1H₂O₂作用细胞24h后，细胞活力下降为65%，具有统计学差异（P<0.01），细胞凋亡率上升（P<0.01）；明显出现了细胞凋亡的形态学特征；增殖指数（proliferation index, PI%）降低（P<0.05）；8-OHdG含量上升（P<0.01）；LDH释放量和细胞内ROS增加（P<0.01），线粒体膜电位下降（P<0.01），细胞内钙离子浓度上升（P<0.01），caspase3和caspase9活性增强（P<0.01）。结论：200μmol L^-1H₂O₂作用细胞24h，细胞活力显著下降，明显造成细胞氧化损伤，造模成功。2没食子酸对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制研究目的：以H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤为模型，探讨没食子酸对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。方法：筛选没食子酸（gallic acid，GA）对SH-SY5Y细胞无毒剂量范围，以此剂量范围研究没食子酸对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。将细胞分为5组。正常对照组（Control）， H₂O₂模型组（Model），GA5μmol L^-1组（GA1）、GA10μmol L^-1组（GA2）、GA25μmol L^-1组（GA3）。GA组先加入GA预处理1h后再加入终浓度为200μmol L^-1H₂O₂。Heochest33258染色观察凋亡细胞的形态学特征；Annexin V-FITC/PI双染，流式检测细胞凋亡率； PI染色流式细胞仪检测细胞周期构成比； diaphorase催化的INT显色反应检测LDH释放量；DCFH-DA检测细胞内ROS；ELISA法检测8-OHdG；JC-1染色检测细胞线粒体膜电位；Fura-2AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度；利用caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA的反应检测caspase3活性；应用caspase9催化特异性底物Ac-LEHD-pNA检测caspase9活性。结果：过氧化氢组与正常对照组相比，终浓度为200μmol L^-1H₂O₂作用细胞24h后，细胞活力下降为65%，具有统计学差异（P<0.01），细胞凋亡率上升（P<0.01）；明显出现了细胞凋亡的形态学特征；增殖指数（proliferation index, PI%）降低（P<0.05）；8-OHdG含量上升（P<0.01）；LDH释放量和细胞内ROS增加（P<0.01），线粒体膜电位下降（P<0.01），细胞内钙离子浓度上升（P<0.01），caspase3和caspase9活性增强（P<0.01）。与H₂O₂损伤组相比，终浓度为5-25μmol·L^-1GA能显著改善上述指标的变化（P<0.05）。结论：GA在一定剂量范围内对H₂O₂诱导的SH-SYSY神经细胞损伤具有明显的保护作用，其保护效应可能与清除ROS，减轻DNA氧化损伤，抑制线粒体通路介导的细胞凋亡有关。3芍药苷对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制研究目的：以H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤为模型，探讨芍药苷对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。方法：筛选芍药苷（paeoniflorin，PF）对SH-SY5Y细胞无毒剂量范围，以此剂量范围研究芍药苷对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。将细胞分为5组。正常对照组（Control）， H₂O₂模型组（Model），PF10μmol·L^-1组（PF1）、PF20μmol·L^-1组（PF2）、PF40μmol·L^-1组（PF3）。PF组先加入PF预处理1h后再加入终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂。Heochest33258染色观察凋亡细胞的形态学特征；Annexin V-FITC/PI双染，流式检测细胞凋亡率；PI染色流式细胞仪检测细胞周期构成比；diaphorase催化的INT显色反应检测LDH释放量；DCFH-DA检测细胞内ROS；ELISA法检测8-OHdG；JC-1染色检测细胞线粒体膜电位；Fura-2AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度；利用caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA的反应检测caspase3活性；应用caspase9催化特异性底物Ac-LEHD-pNA检测caspase9活性。结果：过氧化氢组与正常对照组相比，终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂作用细胞24h后，细胞活力下降为65%，具有统计学差异（P<0.01），细胞凋亡率上升（P<0.01）；明显出现了细胞凋亡的形态学特征；增殖指数（proliferation index, PI%）降低（P<0.05）；8-OHdG含量上升（P<0.01）；LDH释放量和细胞内ROS增加（P<0.01），线粒体膜电位下降（P<0.01），细胞内钙离子浓度上升（P<0.01），caspase3和caspase9活性增强（P<0.01）。与H₂O₂损伤组相比，20-40μmol·L^-1PF能显著改善过氧化氢诱导的上述指标的改变（P<0.05）；终浓度10μmol·L^-1PF组与H₂O₂组相比PI%无显著变化（P>0.05），LDH和8-OHdG含量无显著变化（P>0.05），但能显著改善过氧化氢诱导的细胞凋亡的形态学特征，提高过氧化氢诱导的细胞活力下降（P<0.05），抑制H₂O₂诱导的ROS上升（P<0.05），抑制线粒体膜电位的下降（P<0.05），抑制细胞内钙离子浓度的升高（P<0.05），抑制caspase3和caspase9活性增强（P<0.05），减轻H₂O₂诱导的细胞凋亡率的上升（P<0.05）。结论：PF在一定剂量范围内对H₂O₂诱导的SH-SYSY神经细胞损伤具有明显的保护作用，其保护效应可能与清除ROS，减轻DNA氧化损伤，抑制线粒体通路介导的细胞凋亡有关。4赤芍801对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制研究目的：以H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤为模型，探讨赤芍801对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。方法：筛选赤芍801（propyl gallate，PG）对SH-SY5Y细胞无毒剂量范围，以此剂量范围研究赤芍801对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。将细胞分为5组。正常对照组（Control）， H₂O₂模型组（Model），PG20μmol·L^-1组（PG1）、PG40μmol·L^-1组（PG2）、PG80μmol·L^-1组（PG3）。PG组先加入PG预处理1h后再加入终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂。Heochest33258染色观察凋亡细胞的形态学特征；Annexin V-FITC/PI双染，流式检测细胞凋亡率； PI染色流式细胞仪检测细胞周期构成比；diaphorase催化的INT显色反应检测LDH释放量；DCFH-DA检测细胞内ROS；ELISA法检测8-OHdG；JC-1染色检测细胞线粒体膜电位；Fura-2AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度；利用caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA的反应检测caspase3活性；应用caspase9催化特异性底物Ac-LEHD-pNA检测caspase9活性。结果：过氧化氢组与正常对照组相比，终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂作用细胞24h后，细胞活力下降为65%，具有统计学差异（P<0.01），细胞凋亡率上升（P<0.01）；明显出现了细胞凋亡的形态学特征；增殖指数（proliferation index, PI%）降低（P<0.05）；8-OHdG含量上升（P<0.01）；LDH释放量和细胞内ROS增加（P<0.01），线粒体膜电位下降（P<0.01），细胞内钙离子浓度上升（P<0.01），caspase3和caspase9活性增强（P<0.01）。与H₂O₂损伤组相比，40-80μmol L-PG均能显著改善过氧化氢诱导的上述指标的改变（P<0.05）；终浓度20μmol·L^-1PG组与H₂O₂组相比PI%无显著变化（P>0.05），LDH和8-OHdG含量无显著变化（P>0.05），但能显著改善过氧化氢诱导的细胞凋亡的形态学特征，提高过氧化氢诱导的细胞活力下降（P<0.05），抑制H₂O₂诱导的ROS上升（P<0.05），抑制线粒体膜电位的下降（P<0.05），抑制细胞内钙离子浓度的升高（P<0.05），抑制caspase3和caspase9活性增强（P<0.05），减轻H₂O₂诱导的细胞凋亡率的上升（P<0.05）。结论：PG在一定剂量范围内对H₂O₂诱导的SH-SYSY神经细胞损伤具有明显的保护作用，其保护效应可能与清除ROS，减轻DNA氧化损伤，抑制线粒体通路介导的细胞凋亡有关。5土木香总黄酮对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制研究目的：以H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤为模型，探讨土木香总黄酮对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响。方法：筛选土木香总黄酮（total flavonoids，TF）对SH-SY5Y细胞无毒剂量范围，以此剂量范围研究土木香总黄酮对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响及其机制。将细胞分为5组。正常对照组（Control），H₂O₂模型组（Model），TF5mg·L^-1组（TF1）、TF10mg·L^-1组（TF2）、TF20mg·L^-1组（TF3）。TF组先加入TF预处理1h后再加入终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂。DCFH-DA检测细胞内ROS。结果：过氧化氢组与正常对照组相比，终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂作用细胞24h后，细胞活力显著下降（P<0.01）；与H₂O₂损伤组相比，5-20mg·L^-1TF能显著抑制过氧化氢诱导的凋亡（P<0.05），抑制H₂O₂诱导的ROS上升（P<0.05）。结论：TF在一定剂量范围内对H₂O₂诱导的SH-SYSY神经细胞损伤具有明显的保护作用，其保护机制有待进一步研究。