一、概述帕金森病(Parkinson’s Disease PD)是一种以锥体外系黑质多巴胺(Dopamine DA)能神经元进行性损害为主要病理表现的中枢神经系统退变性疾病。研究发现,当黑质DA神经元数量减少70%时,PD临床症状开始表现,而对于中、晚期PD, DA数量则减少90%以上。国外的统计资料表明,PD的自然发病率为0.1%-0.2%,其中在55岁以上人群其发病率上升为1.4%,75岁以上人群为3.4%。由于我国已经进入老龄化社会,因此,PD的有效治疗不仅有助于缓解病人疾苦,而且能够极大减轻家庭及社会负担。但是,目前的常规治疗(包括内科及外科方法)只限于控制症状,并不能延缓、阻止PD病理的进展。目前已经明确,人脑内多巴胺(dopamine DA)含量约90%左右集中于中脑,尤其是黑质-纹状体区,当此处DA含量下降超过70%时,患者将开始出现PD的临床表现,而DA在脑内生成代谢过程中,中脑内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase TH)起到及其重要的作用,是DA生成的限速酶。研究显示：PD患者脑内TH降低比较明显,而补充中脑TH,可以提高脑内DA含量,并可以改善PD症状,目前有研究显示,干细胞能诱导分化成多巴胺能神经元,因此,寻找合适的干细胞,诱导分化成多安能神经元并行细胞移植治疗成为治疗帕金森病的理想方案。干细胞是一类可以在体内和体外大量自我复制、并能够持续保持不对称分裂特性的细胞群,包括胚胎干细胞、骨髓源性干细胞及脐带间充质干细胞等。在干细胞移植治疗PD的实验中,各种干细胞均收到良好的治疗效果,但是胚胎干细胞受到来源少、操作复杂及伦理道德等限制,骨髓源性干细胞是一种比较理想的干细胞,但是其致瘤性及免疫排斥性限制其进一步的发展,脐带Wharton’s jelly间充质干细胞作为一种新生的干细胞,显示其特殊的优势。脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构,外被羊膜、内含分化的粘液性结缔组织,结缔组织内除闭锁的卵黄囊和尿囊外,还有脐动脉和脐静脉。脐血管的一端与胚胎血管相连,另一端与胎盘绒毛血管续连。血管周围被粘蛋白样组织所包裹,后者被称为脐带胶质,或华尔通胶(Wharto’n sjelly,WJ),它富含透明质酸,形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构。脐带中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干／祖细胞,其中间充质干细胞来源分四种：①来源于Wharton’sjelly;②来源于脐血管周围；③来源于脐血；④来源于脐静脉血管内皮下。Wharton’sjelly间充质干细胞则是来源于脐带Wharton’sjelly组织。脐带间充质干细胞作为一种干细胞种子,生物学特性类似骨髓间充质干细胞,无免疫排斥性,一定诱导条件下能分化成肝细胞,成骨细胞及神经元细胞等,无瘤性,细胞取材容易,分离培养操作简单。本研究通过收集无菌脐带组织,无菌环境下利用胶原酶等处理提取脐带间充质干细胞,通过贴壁培养选择较纯化的干细胞,观察该细胞的生物形态及生物学特性,利用流式细胞仪检测细胞表面抗原,利用一定的诱导方案,分两步诱导细胞分化为多巴胺能神经元,用免疫荧关技术鉴定nestin、nse及TH的表达,同时用weston blot鉴定NSE和TH蛋白在诱导细胞中的表达。二、本研究目的本研究的目的在于获取一种新的种子干细胞：脐带间充质干细胞,鉴定其生物学特性,探讨其分化成多巴胺能神经元的能力,因此本实验主要为两大部分。第一部分探讨脐带间充质干细胞的提取、纯化,鉴定其生物学特性；第二部分探讨脐带间充质干细胞分化为多巴能神经元的可能性,并用免疫荧光和weston blot检测特殊蛋白的表达。三、本试验主要的方法和结果：1.脐带MSCs的分离培养：无菌条件下取足月妊娠健康胎儿的脐带10 cm,用0.01 mol/L PBS浸泡,洗涤残留在血管的血液,清除脐带内血管,撕掉脐带表面的羊膜,即得间充质组织,剪碎至1 mm3大小组织块,DMEM/F12培养基冲洗,250 g离心5 min,弃上清,加入20g/L的Ⅳ型胶原酶,37℃培养箱中消化18 h,250 g离心5 min,弃上清,加入等体积20 g/L胰酶消化20 min,滴加FBS终止消化,吸管吹打至组织分散,250 g离心5 min,弃上清,加入新鲜DMEM/F12培养基重悬,细胞计数,置37℃、5%CO2培养箱中培养。2.脐带MSCs表面标志物的流式细胞学分析：取P3代细胞,密度1×106个/mL,加入荧光素PE标记的抗人CD19、CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD44、CD90、CD105、CD166、HLA-DR,同时设同型阴性对照及空白对照,流式细胞仪检测荧光强度。3.CCK8法绘制脐带MSCs生长曲线：取P2代细胞,密度1.5×104个/mL,接种于96孔板,添加10%FBS,培养24 h后加入10μL CCK8,继续培养1 h后置酶标仪测570 nm处吸光度(OD)值,连续检测7 d。4、细胞周期的测定：取P3代细胞,胰酶消化,70%冷乙醇4℃固定,透膜24 h,用10μg/mL的RnaseA 37℃孵育30 min,加入50μg/mL碘化丙啶4℃避光孵育5min,流式细胞仪检测荧光强度并计算处于G1、S、G2、M各期的细胞比例。5.诱导分化：采用二步诱导法：(1)将P3代脐带MSCs以5×104个/mL2的密度接种25T培养瓶,加入预诱导液DMEM/F12、20 ng/mL BFGF、20 ng/mL EGF及2μLN2,诱导神经干细胞,5d后应用免疫荧光检测神经球Nestin的表达,一抗、二抗分别为兔抗Nestin抗体和荧光标记羊抗兔抗体；(2)6d后,去除预诱导液,取P1代神经干细胞以40000/cm2的密度接种于铺有层粘连蛋白的24孔板,加入诱导液DMEM/F12、100 ng/mL FGF8、200 ng/mL SHH及2 gLN2,对照组不添加FGF8和SHH,每3天半量换液,置37℃、5%C02培养箱中培养3、6、9 d后终止诱导,倒置显微镜下观察。6.免疫荧光染色检测Nestin、TH、NSE的表达：取终止诱导的细胞,40g/L多聚甲醛固定20 min,0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次,加入1.5 g/L Triton-100透膜15 min,0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次,1%BSA封闭30 min,0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次,加入兔抗TH抗体,4℃孵育过夜,0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次,加入荧光标记的羊抗兔二抗,37℃湿盒孵育1 h,0.01 mol/L PBS冲洗5 minx3次,加入DAPI复染,0.01 mol/L PBS冲洗5 minx3次,甘油封闭,荧光镜下观察。免疫荧光染色鉴定Nestin、NSE方法同上,一抗分别为兔抗Nestin、兔抗NSE抗体,二抗为荧光标记羊抗兔抗体。7. Western blotting检测NSE、TH在诱导后细胞中的表达：将终止诱导的各组细胞裂解,进行SDS-PAGE电泳,将电泳后的SDS-PAGE胶在冷却条件下转印PVDF膜(45 V、2 h),转印后的PVDF膜用含9 g/LNaCl的Tris缓冲液冲洗,加入含50g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h, TBST缓冲液洗涤10 minx3次,加入兔抗TH抗体(1：1000),4℃孵育过夜,TBST洗涤,加5 mL稀释的羊抗兔二抗(1：5000,含25g/L脱脂奶粉),37℃反应1 h,然后用TBST洗涤10 minx3次,加入ECL化学发光试剂,完全浸透后,放于一胶片上,盖上保鲜膜,放入X射线暗盒,置于暗房。Western blotting检测NSE方法同上,一抗、二抗分别为兔抗NSE抗体和羊抗兔二抗。8.数据统计：数据用平均数(X)±标准差(s)表示,并采用SPSS10.0软件进行数据分析,采用两因素析因分析。四、全文总结本实验中成功提取脐带间充质干细胞,对其生物学特性进行鉴定,流式细胞仪检测表明,细胞表面分子CD29、CD44、CD73(SH2)、CD90、CD105(SH3)、CD 166均为阳性,而造血干细胞的表面标志CD34、CD45及内皮细胞表面分子CD31均是阴性,B细胞表面标志物CD19阴性,结果表明其与骨髓MSCs非常相近,同时细胞表面分子HLA-DR阴性；同时在神经诱导液中培养,成功诱导出多巴胺能神经元,其表达多巴胺能神经元特殊蛋白TH,和神经元蛋白NSE。总之本实验成功分离出脐带间充质干细胞并诱导出多巴胺嫩神经元。