目的:首先通过网络药理学的研究方法,以“健脾抗癌方”为研究对象,构建“健脾抗癌方-成分靶点-肠癌-疾病靶点”的相互作用网络系统,筛选相互作用靶点,并对其进行GO分析和KEGG分析,预测健脾抗癌方治疗肠癌的分子生物学机制。其次,通过体外实验,以CT26WT肠癌细胞为研究对象,观察不同剂量的健脾抗癌方含药血清对CT26WT细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移的影响;最后,通过体内实验,建立CT26WT肠癌细胞皮下荷瘤模型,观察健脾抗癌方干预后小鼠的一般状态、皮下瘤大小、抑瘤率以及与肿瘤血管生成相关蛋白的表达水平;检测ERK/MAPK信号通路相关指标RAS、ERK、p ERK以及下游MMP2、c-myc蛋白表达情况,揭示其深层次抗肿瘤机制,为健脾抗癌方的临床广泛应用提供实验依据。方法:1基于网络药理学探讨健脾抗癌方治疗肠癌机制的研究:通过文献及TCMSP数据库的检索,对健脾抗癌方包含的中药活性成分根据一定的筛选条件进行有效筛选以及预测相应的靶点,通过Gene Cards等数据库筛选肠癌靶点,对筛选后的成分作用靶点与疾病靶点取交集,构建“药物-疾病”蛋白的相互作用网络系统。最后,对交集进行GO及KEGG富集分析,以推测健脾抗癌方治疗肠癌的分子生物学机制,指导后续的实验研究,并通过实验研究验证网络药理学的推测。2健脾抗癌方含药血清对肠癌CT26WT细胞增殖、迁移影响:将20只SPF级大鼠随机分组,分别给予生理盐水、健脾抗癌方低、中、高剂量及相应剂量的卡培他滨灌胃以制备含药血清。观察健脾抗癌方含药血清对CT26WT肠癌细胞周期的影响;MTT实验检测健脾抗癌方对CT26WT细胞增殖抑制的作用;流式细胞术检测含药血清是否对CT26WT肠癌细胞株的凋亡产生影响;其次,通过Transwell法测定细胞迁移能力。初步探索健脾抗癌方的体外抗肿瘤效果。3健脾抗癌方对CT26WT肠癌细胞移植瘤VEGF、MVD、PKC表达的影响:昆明小鼠,4-6周龄,体重18-20g,40只。将CT26WT肿瘤细胞皮下注射瘤细胞建立小鼠肠癌模型。待昆明小鼠的皮下出现突出于体表的的肿块后,证明小鼠造模成功。并对造模的小鼠编号,随机分成对照组,卡培他滨组,健脾抗癌方低、中、高剂量组。分别予对应的干预措施。干预时间为2周。观察各组小鼠在整个过程中的一般状况（如进食、皮肤状况、活动力、体重等）。在第2周末,通过脱颈的方式处死小鼠后,将小鼠以仰卧位的姿势,并用大头钉固定小鼠的四肢,用眼科剪剥离肿瘤组织,用0.9%氯化钠清洗干净剥离出的肿瘤组织周围的血液,观察各组的抑瘤率;对移植瘤组织细胞进行TUNEL染色检测健脾抗癌方在体内否能诱导细胞发生凋亡;免疫组化检测肿瘤组织中CD34标记MVD的结果;免疫印迹检测移植瘤瘤体组织中血管新生相关蛋白表达VEGF、PKC情况。4健脾抗癌方通过ERK/MAPK信号通路影响肠癌的增殖及血管生成:昆明小鼠,4-6周龄,体重18-20g,40只。将CT26WT肿瘤细胞皮下注射瘤细胞建立小鼠肠癌模型。待小鼠的皮下出现肉眼可见的卵圆形肿块后,说明小鼠造模成功。并对造模的小鼠编号,随机分成对照组,卡培他滨组,健脾抗癌方低、中、高剂量组。分别予不同的干预措施。干预时间为2周。在第2周末,将小鼠脱颈处死后,用大头钉将小鼠以仰卧位姿势固定其四肢,用眼科剪剥离肿瘤组织,用生理盐水清洗干净肿瘤组织周围的血液,免疫印迹检测ERK/MAPK信号中RAS、ERK、p ERK表达的影响;免疫印迹检测c-myc表达的影响;免疫印迹检测MMP2表达的影响。分析的上述实验数据均采用（Mean±SD）形式表示,多组间的比较采用单因素方差分析,两组间的比较采用t检验,以P＜0.05为差异显著,具有统计学的意义。结果:1网络药理学:本部分研究共收集220种化学成分、药物作用靶点230个,1313个肠癌靶点,共有129个交集靶点,通过生物学功能分析,结果显示主要涉及细胞增殖、凋亡、血管生成等方面,通路富集分析发现健脾抗癌方治疗大肠癌可能与影响MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF介导的信号通路密切相关,主要指标有:VEGF、PKC、RAS、ERK、c-myc、MMP2等。2健脾抗癌方含药血清对CT26WT肠癌细胞的体外抗肿瘤效果:2.1健脾抗癌方含药血清对CT26WT细胞增殖影响:与对照组比较,不同剂量的含药血清组作用24h后CT26WT细胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）;待处理48h时后,与24h相比,健脾抗癌方组抑制率显著增加,低、中、高剂量组的组间比较亦具有统计学意义,同时,高剂量含药血清组增殖抑制效果最佳。2.2健脾抗癌方含药血清对CT26WT细胞周期的影响:低、中、高剂量组健脾抗癌方含药血清作用CT26WT细胞后在G1期的比率分别为:50.22%、52.94%、60.32%,卡培他滨组G1期的比率为64.99%,均明显高于对照组的47.56%,差异显著（P＜0.05）。且细胞周期阻滞的比率随药物剂量增加而增加。2.3健脾抗癌方含药血清对CT26WT细胞凋亡的影响:经健脾抗癌方处理后,高剂量含药学清组诱导12.74%细胞的凋亡,中剂量组诱导12.16%细胞的凋亡,低剂量诱导9.46%细胞凋亡,卡培他滨组则诱导了13.82%细胞凋亡。与对照组比较均具有显著差异（P＜0.05）。2.4健脾抗癌方含药血清对CT26WT细胞迁移的影响:不同剂量的健脾抗癌方含药血清组作用细胞后,穿膜细胞个数分别为（46.00±1.87）、（37.40±1.95）、（37.00±2.83）,与对照组（67.80±8.93）相比,均显著下降（P＜0.05）,且随着含药血清剂量的增加而穿膜细胞的数量明显减少。3健脾抗癌方对小鼠一般状态及肠癌细胞移植瘤VEGF、MVD、PKC表达的影响:3.1小鼠一般状态及体重变化:给药2周后,与对照组比较,不同剂量健脾抗癌方组的小鼠精神状态较好,活动力良好,色泽未见明显异常,尤以高剂量组更加显著,健脾抗癌方在一定程度上维持了小鼠状态及体力。卡培他滨组小鼠精神较差,明显消瘦,皮肤色泽晦暗;在饮食方面,卡培他滨组食量亦减少明显。体重方面,造模前各组小鼠体重无差异,经治疗后,各组体重较治疗D0天比较均有所下降,其中对照组、卡培他滨组下降更为明显（P＜0.05）。健脾抗癌方组不同剂量组治疗前、后体重差值较对照组明显减少。3.2健脾抗癌方对抑瘤率影响:不同剂量的健脾抗癌方对小鼠移植瘤生长均具有抑制作用,其高、中剂量组平均瘤重均显著低于对照组（P＜0.05）,尤为高剂量组明显,低剂量组与对照组比较则无明显差异。3.3各组小鼠移植瘤组织TUNEL染色结果:通过TUNEL法检测凋亡细胞可表现出核固缩,荧光更为明亮,呈圆形、新月形或不规则形。镜下结果发现,健脾抗癌方各剂量组的凋亡细胞均较对照组显著增加,组间比较差异显著（P＜0.05）。3.4肿瘤组织中CD34标记MVD检测结果:结果显示:CD34表达在对照组中为（60.67±10.50）,健脾抗癌方低、中、高剂量组分别为（44.24±8.00）、（39.26±8.57）、（28.83±9.81）,与对照组比较明显降低,具有统计学意义（P＜0.05）,其中高剂量组差异最显著。3.5健脾抗癌方小鼠移植瘤血管新生的影响:研究显示:对照组中VEGF平均光密度值为（56.73±5.03）,低、中、高健脾抗癌方组中的分别为（45.50±7.19）、（32.23±2.33）、（40.59±2.76）,与对照组相比,均具有统计学意义（P＜0.05）,可以看到健脾抗癌方中剂量组的抑制最为显著。同时,对于PKC的影响,经健脾抗癌方作用后,PKC的表达与对照组相比明显降低,差异显著（P＜0.05）,高剂量组抑制效果最明显。4健脾抗癌方对ERK/MAPK信号通路及下游通路相关蛋白影响:4.1健脾抗癌方对ERK/MAPK信号中RAS、ERK、p ERK蛋白表达的影响:与对照组相比,健脾抗癌方低、中剂量组均能降低RAS蛋白的表达,具有统计学差异。同时,各组健脾抗癌方的ERK蛋白含量无明显变化,不具有统计学差异。但其磷酸化形式的p-ERK随着健脾抗癌方浓度的增加出现明显下降趋势,尤其是中、高剂量的p-ERK变化最显著。4.2健脾抗癌方对蛋白表达MMP2的影响:结果表明,与对照组比较,健脾抗癌方低、中剂量组均能降低MMP2蛋白的表达,具有明显地统计学意义（P＜0.05）。4.3健脾抗癌方对蛋白表达c-myc的影响:研究结果显示:经不同剂量的健脾抗癌方处理后c-myc的蛋白表达水平均有不同程度下降,与对照组相比,差异显著（P＜0.05）。其以中剂量组的下降最为显著。同时健脾抗癌方中、高剂量组间比较时并无统计学差异。结论:1基于网络药理学初步探索健脾抗癌方治疗肠癌的主要活性成分以及潜在分子学机制,主要涉及了增殖、凋亡、血管生成,通路涉及ERK/MAPK信号通路等。2体外实验初步证实健脾抗癌方含药血清可抑制CT26WT细胞增殖,阻滞细胞周期在G1期,促进细胞凋亡,同时还可抑制肠癌细胞的迁移能力,呈现出一定的剂量依赖性。3体内实验表明健脾抗癌方具有较好抑瘤效果,一定程度上维持了小鼠状态、体力及体重;同时可抑制VEGF、MVD、PKC表达。4体内实验进一步表明健脾抗癌方可能是通过阻断ERK/MAPK信号通路的RAS、p-ERK表达,同时降低了下游MMP2、c-myc蛋白的表达,最终抑制了CT26WT细胞的增殖、血管生成以及迁移能力。