研究背景和目的临床上膜增生性肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎等以肾病综合征为主要临床表现的肾小球肾炎及其他各种肾脏疾病(如糖尿病肾病、狼疮性肾炎等)尽管发病原因各不相同,但其共同特点是患者体内脂质代谢紊乱,主要表现为高血脂症,同时常常伴发肾小球系膜细胞大量增生,在临床过程上往往呈慢性进展,最后发生进行性肾小球纤维化及肾脏硬化,是导致慢性肾脏病(CKD)发生发展的最主要原因。近年来CKD晚期病变-终末期肾病(ESRD)已经成为人类主要健康问题之一,在世界范围内CKD和ESRD发病率逐年上升。美国国立卫生研究院2004年的统计数据表明,近年来美国死亡率最高的恶性肿瘤、心脏病等几种疾病的发生率正在逐渐降低,而CKD发病率却明显增加。研究表明美国成年人CKD的发生率约为11%,至2010年美国ESRD患病人数至少增加12万余人,美国全国ESRD病人达到65万余人,同时,CKD患者伴发心脑血管疾病等明显增加,因此随着社会经济的发展以及人们饮食结构的改变,ESRD和CKD已经日益成为人们需要面临的主要健康问题。CKD的主要病理学表现是肾脏组织的纤维化,有研究者认为肾小管病变导致的肾脏间质纤维化在慢性肾脏疾病的发生发展过程中起着重要的作用,尤其是糖尿病肾病等许多伴发高血脂症的肾脏疾病患者被认为是由脂质引发的肾毒性作用导致,其机制可能涉及低密度脂蛋白对肾小管上皮细胞的活化,大量脂质沉积于肾小管内以及释放某些活性细胞因子等,并且认为肾小管病变导致的肾脏疾病严重程度较肾小球病变的后果要严重,故近年来的文献报道多集中于肾小管方面的研究,然而肾小球的病变常常导致肾小球率过滤及肾脏血流动力学等的变化,这样就会使肾小球入球小动脉或出球小动脉血流减少以致中断,因此会使血供主要来自肾小球出球小动脉的肾小管发生一系列病变如萎缩变性或坏死等,所以可以认为肾小球疾病是不少肾小管病变的触发和始动因素,而许多肾小管疾病则可能是来自于肾小球病变的继发性改变。因此,有必要加强对肾小球疾病的相关研究。近年来发现在由各种肾小球肾炎导致ESRD和CKD的过程中,作为肾小球最重要固有细胞的系膜细胞在其中发挥着重要的作用,尤其是在各种损伤因素作用下,系膜细胞的转分化现象越来越引起众多研究者的注意。系膜细胞(MsC)是肾小球内三种固有细胞成份中功能最活跃的一种,也是肾脏疾病中各种致病因子作用的主要靶细胞。作为肾小球内固有的血管周细胞,组织学与胚胎学研究证实,肾小球系膜细胞与血管平滑肌细胞具有同源性。与血管平滑肌细胞相似,系膜细胞在不同时期或不同状态下具有不同的细胞亚型。在胚胎及幼体肾小球发育期,系膜细胞增殖活跃,细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阳性,此时的细胞类型为增殖/分泌型。随着机体肾小球的逐渐发育,成熟的系膜细胞更替速度缓慢,处于低代谢、非激活的静息状态,细胞内未见α-SMA表达,被称为静止型细胞。生理情况下,处于静止型的系膜细胞,仅行使吞噬及维持细胞外基质正常代谢的功能,但在病理条件下,受外界刺激因素的影响,系膜细胞可以发生转分化,重新变为增殖/分泌型细胞,此时的系膜细胞可以称之为肌成纤维细胞(MFB),细胞骨架以表达α-SMA为主要特点,其形态发生改变,并伴随系膜细胞增殖和细胞外基质增多,逐渐发展为肾小球硬化,此为肾脏硬化形成的重要步骤,因此系膜细胞的转分化作用具有重要的生理和病理意义。众所周知,高血脂症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一,高血脂症中低密度脂蛋白与动脉粥样硬化的关系尤其密切。在体内由于氧化应激等各种病理因素的影响低密度脂蛋白非常容易被氧化转变为氧化修饰型低密度脂蛋白(ox-LDL),近年来的研究结果已经明确氧化修饰型低密度脂蛋白较低密度脂蛋白具有更强的致动脉粥样硬化作用。在由各种肾小球肾炎及糖尿病肾病导致的机体脂质代谢紊乱中,血浆低密度脂蛋白浓度异常升高亦更加受到研究者们的注目。Virchow早在100多年前在描述Bright’s肾病时就曾经提出过“脂质变性”这一观点,此后20世纪80年代英国学者Moorhead又提出血浆脂质代谢异常导致肾脏毒性学说,近年来越来越多的实验证实高血脂症与肾脏硬化有密切的关系,而肾小球纤维化与动脉粥样硬化在组织形态学上的改变和发生机制上有一定程度的相似性,如均表现为某些细胞在局部的大量增生,胶原纤维等细胞外基质在局部组织的聚集等。研究显示,在氧化修饰型低密度脂蛋白致动脉粥样硬化的过程中血管平滑肌细胞表型的调整起着重要的作用,由此可以推测作为与血管平滑肌细胞在组织胚胎学上具有相同起源的肾小球系膜细胞,于高血脂症条件下受氧化修饰型低密度脂蛋白刺激,在肾小球肾炎及肾小球纤维化的发生发展过程中可能也具有重要的病理学意义。因此对系膜细胞在氧化修饰型低密度脂蛋白等病理条件作用下的增殖及转分化规律进行深入研究将有助于加深对肾小球肾炎及肾小球纤维化的发生及其慢性进展机制的认识。事实上在肾脏疾病逐渐进展的过程中,肾小球系膜细胞及系膜区的改变是主要的病变环节,但目前对肾小管类疾病的关注程度较高,对肾脏固有细胞转分化作用等的相关实验也多集中于肾小管上皮细胞与肾间质的关系及某些炎症介质、细胞因子对系膜细胞的作用上,而对氧化修饰型低密度脂蛋白能否直接诱导体外培养的系膜细胞发生转分化作用及对其超微结构的体视学分析等研究则未见相关报道。本实验拟在细胞水平上应用氧化修饰型低密度脂蛋白作用于体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,研究其对系膜细胞增殖及细胞周期变化、诱导系膜细胞发生转分化及其对系膜细胞线粒体等超微结构和功能的影响,探讨氧化修饰型低密度脂蛋白活化的系膜细胞在肾小球肾炎及其纤维化中的作用和可能机制。方法1.大鼠系膜细胞体外培养及ox-LDL对大鼠系膜细胞毒性实验大鼠肾小球系膜细胞购于武汉中国典型培养物保藏中心。实验中大鼠肾小球系膜细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置37℃, 5%CO2饱和培养箱内培养。以每2～3天的周期换液和传代,取消化后的MsC培养24小时后细胞接近于铺满孔底时换无血清RPMI1640培养液培养24小时,使多数细胞同步于静止期后分为空白对照组(培养液中不含ox-LDL)及ox-LDL诱导组(ox-LDL终浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml)于培养后72小时收集细胞,利用台盼蓝拒染实验,进行活细胞计数,观察氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞毒性作用。2.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞增殖水平及其细胞周期变化的影响利用四唑氮盐(MTT)实验检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于大鼠肾小球系膜细胞不同时间后对其体外增殖能力的影响;通过绘制细胞7天生长曲线图观察氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞在较长时间内生长趋势的影响;利用流式细胞技术检测氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞增殖周期分布的影响;利用流式细胞技术检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞不同时间后诱导其增殖细胞核抗原表达的情况。3.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞α-SMA、CTGFmRNA及其蛋白和FN、Ⅳ型胶原表达的影响利用透射式电子显微镜及Western Blot观察检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于大鼠肾小球系膜细胞72小时后转分化标记物-α-平滑肌肌动蛋白表达;利用RT-PCR 检测 α- SMAmRNA、CTGF mRNA 的表达;利用 Western Blot 检测 CTGF蛋白的表达;应用ELISA检测系膜细胞培养上清液中FN和Ⅳ型胶原的表达。4.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞迁移能力及线粒体功能的影响应用Transwell迁移法检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞72小时后对系膜细胞体外迁移能力的影响;利用检测系膜细胞线粒体细胞色素C氧化酶活性变化的方法观察氧化修饰型低密度脂蛋白对线粒体功能变化的影响。5.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞形态结构的影响利用透射式电子显微镜观察氧化修饰型低密度脂蛋白作用于大鼠肾小球系膜细胞72小时后对细胞线粒体等超微结构变化的影响;为研究氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞线粒体这一重要细胞器超微形态结构的影响,对经氧化修饰型低密度脂蛋白(50μg/ml)作用72小时前后的系膜细胞线粒体超微形态结构进行了体视学研究,透射电镜下计算刺激前后系膜细胞线粒体的体积密度、表面积密度、数密度、平均体积和平均表面积。6.统计分析方法所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计学软件对定量实验结果进行分析。MTT法检测系膜细胞增殖结果采用双因素析因方差分析,同一因素各个水平之间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),若方差齐性取F值,若方差不齐则采用Welch值,多重比较在方差齐性时采用SNK检验,方差不齐时采用Tamhane’s T2法,线粒体体视学参数测试结果采用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.大鼠肾系膜细胞体外培养及氧化修饰型低密度脂蛋白细胞毒性作用台盼蓝染色结果显示,不同浓度氧化修饰型低密度脂蛋白作用72小时后,对照组及ox-LDL诱导组系膜细胞的细胞活力分别为(0.964±0.009 ),(0.961±0.006), (0.970±0.005),(0.969±0.013),(0.965±0.012),即系膜细胞的细胞活力均在95%以上,组间均数没有统计学差异(F=0.641, P=0.642)。说明实验中氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞增殖、转分化等细胞生物学行为的影响,均为对95%以上的活细胞产生作用,实验证明25～100μg/ml氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞无明显毒性作用。2.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠肾小球系膜细胞增殖水平及其细胞周期变化的影响系膜细胞生长曲线显示氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞的生长具有明显的促进作用,在培养后第1～3天生长相对较慢,第4～6天生长速度明显加快,其后速度相对稳定,进入平台期。MTT法对不同浓度氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞不同时间吸光度的测定,对照组及ox-LDL诱导组系膜细胞24h分别为:(0.898±0.065 ),(1.645±0.086),(2.092±0.170),(2.309±0.168),(2.572±0.057); 48h分别为:(0.956±0.059),(1.939±0.058),(2.170±0.054),(2.524±0.168), (2.745±0.055);72h分别为:(1.281±0.053),(2.484±0.245 ),(2.662±0.087),(2.765±0.131),(2.912±0.079)。析因方差分析表明,不同浓度氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞增殖结果组间均数的差异有统计学意义(F=286.953, P<0.001),氧化修饰型低密度脂蛋白作用不同时间对系膜细胞增殖组间均数的差异也有统计学意义(F=76.209, P<0.001),氧化修饰型低密度脂蛋白浓度和时间双因素之间存在交互效应(F=2.735, P=0.022),氧化修饰型低密度脂蛋白促进系膜细胞的增殖与其作用浓度和作用时间有关。流式细胞术检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞72小时后对照组和ox-LDL诱导组细胞周期各时相分别为:Go/G1期:(96.21±2.41)%、(93.66±0.77)%、(89.96±2.53) %、(86.92±1.68) %、(81.37±2.16) %; S期:(3.62±1.66) %、(6.05±0.72) %、(9.17±1.58) %、(12.95±1.46) %、(17.43±2.41) %。分析结果表明,不同浓度的氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞增殖周期中Go/G1期、S期组间均数的差异有统计学意义(F=33.321, P<0.001; F=44.048, P<0.001)。流式细胞术检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞72小时后对照组和ox-LDL诱导组增殖细胞核抗原的表达分别为(2.31±0.13),(6.82±0.27),(11.61 ±0.65),(18.44±0.18),(26.65±0.71),其表达结果组间均数的差异具有统计学意义(F=1764.774, P<0.001)。3.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠肾小球系膜细胞形态结构的影响透射电镜下对照组系膜细胞表面的微绒毛积聚,数量较多,微绒毛细长,细胞核膜光滑平整,胞浆中粗面内质网等结构较少。在氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72h后,系膜细胞的形态结构逐渐发生明显的变化。当氧化修饰型低密度脂蛋白浓度在25～50μg/ml时,系膜细胞胞体两端稍稍突起,细胞体积逐渐增大,细胞表面仍有微绒毛存在,形态由细长变为短粗,细胞核膜内陷,形状不规则;当氧化修饰型低密度脂蛋白浓度在75～100μg/ml时,系膜细胞胞体逐渐延长肥大,细胞表面的微绒毛数量明显减少,形态由细长变为短粗,尤其是当氧化修饰型低密度脂蛋白浓度达100μg/ml时,系膜细胞形态呈长梭形,细胞的两端明显突起,细胞表面未见明显的微绒毛,细胞浆内线粒体和粗面内质网等亚细胞结构丰富,细胞内可见明显沿细胞核膜外分布、呈束状排列的肌动蛋白样结构。透射式电子显微镜显示的系膜细胞形态学及其超微结构变化表明,在氧化修饰型低密度脂蛋白诱导下,系膜细胞已经发生转分化,其细胞形态及结构呈典型的肌成纤维细胞特征。4.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠肾小球系膜细胞α-SMA、CTGF mRNA及其蛋白和FN、Ⅳ型胶原表达的影响RT-PCR检测系膜细胞α-SM Am RN A结果显示其在对照组细胞中有微弱的基础表达(0.210±0.015),经氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72小时后RT-PCR检测α-SMAmRNA 结果为:(0.681±0.027 )、( 0.984±0.015 )、( 1.387±0.026 )、(1.938±0.029); RT-PCR检测系膜细胞CTGF mRNA结果显示其在对照组细胞中有微弱的基础表达(0.500±0.013),经氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72小时后RT-PCR检测CTGFmRNA结果为(0.940±0.064)、(1.210±0.011)、(1.271±0.043)、(1.473±0.035),分析表明α-SMA及CTGFmRNA表达结果组间均数的差异有统计学意义(F=3241.339,P<0.001; F=377.897,P<0.001); Western Blot检测α-SMA蛋白结果显示其在对照组细胞中有少量表达(0.097±0.042),经氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72小时后Western Blot检测α-SMA结果为(0.247±0.019 )、(0.452±0.068)、(0.562±0.018)、(0.758±0.073),Western Blot检测CTGF蛋白结果显示其在对照组细胞中有少量表达(0.086±0.035),经氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72小时后Western Blot检测CTGF结果为(0.683±0.206)、(0.986±0.153)、(1.411±0.153)、(1.747±0.057),分析表明α-SMA及CTGF蛋白表达结果组间均数的差异有统计学意义( =108.708, P<0.001; F=88.634, P<0.001); ELISA检测结果显示对照组FN有少量表达(3.03±0.41),经氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72小时后FN表达结果为(6.38±0.57)、( 10.44±0.35)、( 14.71±0.76)、( 19.23±0.59);ELISA检测结果显示对照组Ⅳ型胶原有少量表达(8.65±3.13)经氧化修饰型低密度脂蛋白诱导72小时后Ⅳ型胶原表达结果为(16.01±1.89)、(25.23±2.91)、(32.95±3.30)、(38.71±2.27),分析表明FN及Ⅳ型胶原表达结果组间均数的差异有统计学意义(F=539.784,P<0.001; F=78.799,P<0.001)。5.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞体外迁移能力的影响Transwell迁移实验检测氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞72小时后细胞体外迁移的结果显示,空白对照组和氧化修饰型低密度脂蛋白诱导组迁移的系膜细胞数量分别为(10.25±3.50)、(19.75±4.65)、(30.00±6.00)、(42.75±4.57)、(66.25±5.56),组间均数的差异有统计学意义(F=78.064, P<0.001),说明在氧化修饰型低密度脂蛋白作用下系膜细胞体外迁移运动的水平得到明显的提升。6.氧化修饰型低密度脂蛋白对大鼠肾小球系膜细胞线粒体功能的影响氧化修饰型低密度脂蛋白作用于系膜细胞72小时后,对照组和氧化修饰型低密度脂蛋白诱导组线粒体细胞色素C氧化酶活性检测结果为(117.37±51.81)、(296.71±83.27)、(477.85±150.53)、(765.72±187.71)、(953.28±176.13),组间均数的差异有统计学意义(F=23.435, P<0.001),说明在氧化修饰型低密度脂蛋白作用下系膜细胞线粒体功能得到加强,可提供更多的能量以供细胞活动需要。7.氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞线粒体超微结构影响的体视学测量氧化修饰型低密度脂蛋白(50μg/ml)作用于系膜细胞72小时后,空白对照组和ox-LDL诱导组细胞透射电镜10000倍观察系膜细胞线粒体的参数值分别为:空白对照组:体积密度为(1.283±0.061 )、表面积密度(μm2/3)为(0.113±0.005 )、数密度(μm-3)为(0.047±0.005 )、平均体积(μμm3)为(2.863±0.230)、平均表面积(μm3)为(1.175±0.167)。ox-LDL诱导组:体积密度为(0.135±0.006 )、表面积密度(μm2/3)为(1.171±0.005) 、数密度(μm-3)为(0.499±0.004 )、平均体积(μm3)为(2.410±0.913)、平均表面积(μm3)为(6.912±0.943)。两组各指标组间均数的差异均有统计学意义(体积密度t=83.550, P<0.001;表面积密度t=-632.015,P<0.001;数密度t=-31 1.759,P<0.001;平均体积t=6.749,P<0.001;平均表面积t=-59.867,P<0.001)。结论1.氧化修饰型低密度脂蛋白能够促进系膜细胞增殖,该效应可能与其刺激系膜细胞增殖细胞核抗原表达,使系膜细胞增殖周期发生变化有关;2.氧化修饰型低密度脂蛋白可以影响肾小球系膜细胞的形态、超微结构及线粒体的功能;3.氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞具有转分化作用,即系膜细胞向肌成纤维细胞转化,α-SMA表达增强,促进细胞分泌FN、Ⅳ胶原等细胞外基质以及CTGF等细胞因子;4.氧化修饰型低密度脂蛋白通过对系膜细胞的上述作用,与系膜细胞增殖性肾炎病程进展关系密切,可以导致或加重肾小球纤维化,是肾小球纤维化的危险因素。本研究创新之处1.从体外细胞培养的角度首次证实氧化修饰型低密度脂蛋白对系膜细胞的促增殖作用主要是通过促进增殖细胞核抗原表达,改变细胞周期分布而实现的;2.首次证实氧化修饰型低密度脂蛋白可以影响系膜细胞的形态、超微结构并诱导系膜细胞发生转分化现象;3.首次利用生物体视学的原理和方法对氧化修饰型低密度脂蛋白作用下系膜细胞形态及超微结构的变化进行了定量分析,为揭示氧化型低密度脂蛋白对系膜细胞转分化作用的部分机制提供了支持。